121基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序一、获取目的基因(一)、目的基因的概念及基因的结构1、目的基因主要是指______________________，编码蛋白质的结构基因也可以是一些起调控作用的因子原核细胞基因真核细胞基因结构图编码区连续性编码序列位置非编码序列位置2、原核细胞基因与真核细胞基因的比较连续不连续非编码区非编码区和编码区中的内含子编码区编码区中的外显子(二)、获取目的基因的常用方法1、从基因文库中获取目的基因(1）、基因文库概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库基因组文库与部分基因文库的比较文库类型基因组文库cDNA文库构建方法基因多少文库大小有无启动子有无内含子物种间基因交流大某种生物的全部基因某种生物的部分基因小有无有无部分基因可以可以（2）基因文库的类型（3）、从基因文库中筛选目的基因应考虑的因素：序列、功能、位置转录产物、表过产物等(1）、PCR的原理：DNA双链复制2、PCR技术（多聚酶链式反应）5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/A—G引物Ⅰ5/3/G—G引物Ⅱ(2）、PCR过程变性（90℃-95℃）：高温使H键断裂，形成单链DNA复性（55℃-60℃）：引物与DNA模板结合，延伸（70℃-75℃）在Taq酶的作用下，以dATP\dTTP\dGTP\dCTP为原料合成与模板互补的子链（3)、特点：指数式扩增（约2n）（4)、前提：模板：引物：原料：酶：一段已知目的基因的核苷酸序列（以便根据已知序列合成引物）目的基因2条（人工合成，2条引物不一定互补）dCTP、dGTP、dATP、dTTP耐高温DNA聚合酶（Taq酶）PCR技术与生物体内DNA复制的比较项目PCR技术DNA复制不同点解旋方式相同点高温变性解旋解旋酶催化场所体外主要在细胞核内酶热稳定的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶温度条件在较高温度下进行，不同过程温度不同常温原理DNA双链复制原料四种游离的脱氧核苷酸条件需模板、能量、酶等用DNA合成仪合成3、化学方法人工合成适用于核苷酸序列已知且碱基数较少的基因二.基因表达载体的构建——基因工程的核心：1、目的。①使目的基因在_________中稳定存在，并且可以遗传给下一代。②使目的基因能够_____和发挥作用。2、组成：_______+目的基因+_______+标记基因(如抗生素抗性基因)受体细胞表达启动子终止子3、基因表达载体的构建过程：限制酶A识别：5‘-ATGATCAT3’-TACTAGTA，切割位点是T与G之间；限制酶B识别：5‘-CAGATCTG3’-GTCTAGAC，切割位点是A与G之间但是它们产生的粘性末端都是：GATC—只能用同一种限制酶吗？例1.(20分)(2014·天津高考)嗜热土壤芽孢杆菌产生的β-葡萄糖苷酶(BglB)是一种耐热纤维素酶。（1）PCR扩增bglB基因时，选用嗜热土壤芽孢杆菌基因组DNA作。（2）、下图为质粒限制酶酶切图谱。bglB基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的bglB基因重组进该质粒，扩增的bglB基因两端需分别引入和不同限制酶的识别序列。NdeⅠBamHⅠ模板例2.下图是将某细菌的基因A导入大肠杆菌，制备“工程菌”的示意图据图回答：(1)获得A有两条途径：一是以A的mRNA为模板，在酶的催化下，合成互补的单链DNA，然后在的作用下合成双链DNA；二是根据目标蛋白质的序列，推测出相应的mRNA序列，再按照碱基互补配对原则，推测其DNA的序列，再通过化学方法合成所需基因。(2)利用PCR技术扩增DNA时，需添加的有机物质有4种脱氧核糖核苷酸耐热性的和、。(3)由A和载体B拼接形成的C通常称为。(4)在基因工程中，常用Ca2+处理D，其目的是逆转录DNA聚合酶氨基酸脱氧核苷酸引物模板(A基因)基因表达载体使其成为感受态细胞，有利于吸收重组DNA分子DNA聚合酶例3、以下实例为体外处理“蛋白质-DNA复合体”获得DNA片段信息的过程图。据图回答：(1)过程①酶作用的部位是，此过程只发生在非结合区DNA，过程②酶作用的部位是。(2)①②两过程利用了酶的特性。(3)若将得到的DNA片段用于构建重组质粒，需要将过程③的测序结果与酶的识别序列进行比对，以确定选用何种酶。(4)如果复合体中的蛋白质为RNA聚合酶，则其识别、结合的DNA序列区为基因的。磷酸二酯键肽键专一性限制性核酸内切启动子(或转录起始区)(5)以下研究利用了生物分子间特异性结合性质的有(多选)A.分离得到核糖体，用蛋白酶酶解后提取rRNAB.用无水乙醇处理菠菜叶片，提取叶绿体基粒膜上的光合色素C.通过分子杂交手段，用荧光物质标记的目的基因进行染色体基因定位D.将抑制成熟基因导入番茄，其mRNA与催化成熟酶基因的mRNA互补结合，终止后者翻译，延迟果实成熟A、C、D例4.(2014·新课标全国卷Ⅱ)植物甲具有极强的耐旱性，其耐旱性与某个基因有关，若从该植物中获得该耐旱基因，并将其转移到耐旱性低的植物乙中，有可能提高后者的耐旱性。回答下列问题：(1)理论上，基因组文库含有生物的基因；而cDNA文库含有生物的基因。(2)若要从植物甲中获得耐旱基因，可首先建立该植物的基因组文库，再从中出所需的耐旱基因。全部部分筛选(4)将耐旱基因导入农杆菌，并通过农杆菌转化法将其导入植物乙的体细胞中，经过一系列的过程得到再生植株。要确认该耐旱基因是否在再生植株中正确表达，应检测此再生植株中该基因的，如果检测结果呈阳性，再在田间试验中检测植株的是否得到提高(4)假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交，子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为3∶1时，则可推测该耐旱基因整合到了(填“同源染色体的一条上”或“同源染色体的两条上”)。(三)将目的基因导入受体细胞转化:方法导入植物细胞导入动物细胞导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞法目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达1、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法(适合双子植物)（2）基因枪法（3）花粉管通道法2、将目的基因导入动物细胞---显微注射法3、将目的基因导入微生物细胞（1）原核生物特点：单细胞、遗传物质少、繁殖快（2）方法步骤：用Ca2+处理细胞得到感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子四.目的基因的检测与鉴定：步骤检测内容方法标记基因筛选筛选出含目的基因的细胞利用标记基因进行筛选分子检测第一步转基因生物的DNA上是否插入了_________DNA分子杂交技术(DNA和DNA之间)第二步目的基因是否转录出了_____分子杂交技术(DNA和mRNA之间)第三步目的基因是否翻译成_______抗原—抗体杂交技术个体生物学水平鉴定抗虫或抗病接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度目的基因mRNA蛋白质1、利用标志基因进行筛选的原理与方法为了检测重组质粒是否导入原本无ampR和tetR的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是___________________________，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是_______________。能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素pBR322质粒2、DNA分子杂交的原理与方法变性2.(2015·威海模拟)科学家将人的生长激素基因与某种细菌(不含抗生素抗性基因)的DNA分子进行重组，并成功地在该细菌中得以表达(如下图)。请据图分析回答：(1)过程①所示获取目的基因的方法是。(2)细菌是理想的受体细胞，这是因为它。(3)质粒A与目的基因结合时，首先需要用酶将质粒切开“缺口”，然后用酶将质粒与目的基因“缝合”起来。逆转录法(反转录法)繁殖快、单细胞、遗传物质较少限制性核酸内切DNA连接(4)若将细菌B先接种在含有的培养基上能生长，说明该细菌中已经导入外源质粒，但不能说明外源质粒是否成功插入目的基因；若将细菌B再重新接种在含有的培养基上不能生长，则说明细菌B中已经导入了插入目的基因的重组质粒。(5)检测工程菌中的生长激素基因是否转录出mRNA和是否翻译出生长激素，可采用的技术分别是、。氨苄青霉素四环素核酸分子杂交抗原—抗体杂交4.(2015·唐山模拟)基因工程是在现代生物学、化学和工程学基础上建立和发展起来的，并有赖于微生物学理论和技术的发展运用。基因工程基本操作流程如下图，请据图分析回答问题：(1)图中A是。(2)在上述基因工程的操作过程中，可以遵循碱基互补配对原则的步骤有(用图解中序号表示)。(3)不同种生物之间的基因移植成功，从分子水平分析，进行基因工程的主要理论依据是不同生物的DNA结构的基本形式(填相同、不相同)，也说明了生物共用一套。载体①②④相同遗传密码子(4)研究中发现，番茄体内的蛋白酶抑制剂对害虫的消化酶有抑制作用，导致害虫无法消化食物而被杀死，人们成功地将番茄的蛋白酶抑制剂基因导入玉米体内，玉米获得了与番茄相似的抗虫性状，玉米这种变异的来源是。基因重组(5)科学家在某种植物中找到了抗枯萎病的基因，并用基因工程的方法将该基因导入金茶花叶片细胞的染色体DNA上，经培养长成的植株具备了抗病性，这说明目的基因(抗枯萎病的基因)已。如果把该基因导入叶绿体DNA中，将来产生的配子中___________(填“一定”或“不一定”)含有抗病基因。表达不一定【解析】(1)图中A是运载目的基因的载体。(2)基因工程的操作步骤包括获取目的基因，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测与鉴定。只有将目的基因导入受体细胞过程不遵循碱基互补配对原则。(3)基因工程的操作基础是不同生物的DNA结构基本形式相同，且共用一套遗传密码子。(4)基因工程又称DNA重组技术，其变异原理为基因重组。(5)如果把抗枯萎病的基因导入叶绿体DNA中，将来产生的雌配子中可能含有抗病基因，雄配子中不含抗病基因。【考题回访】1.(2015·石家庄模拟)据图表回答问题：(1)假设所用的限制酶均能将所识别的位点完全切开，采用EcoRⅠ和PstⅠ酶切含有目的基因的DNA，能得到种DNA片段。如果将质粒载体和含目的基因的DNA片段只用EcoRⅠ酶切，酶切产物再加入DNA连接酶，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有、、、4质粒—质粒连接物目的基因—目的基因连接物质粒—目的基因连接物(2)为了防止目的基因和质粒表达载体酶切后的末端任意连接，酶切时应该选用的酶是、。EcoRⅠSmaⅠ（3）若启动子位于图中质粒SmaⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间(左侧)，能否用EcoRⅠ和SmaⅠ进行切割，进而连接？为什么？不能。这样会使质粒中的启动子丢失，使形成的基因表达载体无法转录。不能转录出信使RNA，不能编码蛋白质。有调控序列，如启动子和终止子：能转录出信使RNA，能编码蛋白质编码区非编码区原核细胞基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子2、原核细胞的基因结构注意：启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子：启动子和终止子位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止；起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译的起始和终止。3：真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子（不编码蛋白质）外显子（编码蛋白质）启动子终止子编码区上游编码区下游