12第十二章现代生物技术在发酵工业中的应用1已.

第十二章现代生物技术在发酵工业中的应用第一节概述第二节工程菌的发酵第三节动植物细胞的组织培养第四节固定化细胞发酵第一节概述生物技术(biotechnology)，又称生物工程或生物工艺学等。它是近代发展非常迅速的一门综合性科学技术，涉及许多科学领域。生物技术是应用生物科学的理论、方法和技术，按照人们设计的蓝图，改良和加工生物或用生物及其制备物作为加工原料，提供所需的生物制品，为人类服务的综合性科学技术。综合性科学技术知识密集型新产业应用领域很宽（农、工、食、药等）基因工程细胞工程酶工程发酵工程生物技术（生物工程）发酵工程是生物技术产业化的基础和关键技术，是生物技术四大支柱的核心，无论传统发酵产品，如抗生素、氨基酸等，还是现代基因工程产品，如疫苗、人体蛋白质等，都需要发酵技术进行生产。生物技术中，当前人们最感兴趣的是基因工程和细胞工程，它们是生物技术的主导领域，也是热点。发酵工程和酶工程等也是生物技术中的重要组成部分。这几方面的内容是相互联系和互相促进的。1、工程菌的来源基因工程菌：在生物体外对DNA分子进行重新组合，然后克隆到适合的宿主细胞，进行增殖和表达，所得到的重组菌株即是工程菌。2、生产用工程菌应具备条件①产品高浓度、高转化率和高产率；分泌型菌株最好；②能利用常用的碳源(如糖蜜、淀粉等)，并可进行连续培养；③菌株不致病，也不产生内毒素；④发酵所产生的热量和需氧量都低，发酵温度适当；⑤代谢控制容易进行；⑥重组DNA稳定，不易脱落。第二节工程菌的发酵一、工程菌的来源和应用3、工程菌的应用蛋白类药物产品：如胰岛素、干扰素、生长激素等，还有几十种正在开发中。氨基酸生产：如高产的苏氨酸工程菌。维生素生产：能直接转化葡萄糖为2-酮基-L-古龙酸的工程菌，为维生素C生产开辟了新的途径。抗生素生产：如将头孢菌素生物合成的限制性扩环酶基因克隆到产生菌中，使头孢菌素C的产量提高了15％。比较成熟的基因工程产品(一)基因重组细胞的种类原核：大肠杆菌和枯草杆菌真核：酵母菌和哺乳动物细胞等。二、工程菌的培养(二)工程菌的培养工程菌培养：类似于普通微生物的培养。另外要考虑：营养物质的浓度有毒代谢物质的排放导入基因的稳定性基因的转录效率、翻译产物向外分泌等因素。1．培养装置重组大肠杆菌——通气搅拌罐实验室中以基础实验设备进行（一般采用通气搅拌发酵罐，如：大肠杆菌）；但操作要谨慎，防止工程菌株的外漏和扩散；中试试验必须要有良好的重复性，应用全自动的控制系统，减少接触，并且尽可能地获得大量的发酵参数。工程菌的培养装置既要防止外界微生物侵入罐内，污染杂菌，又必须不使重组体外漏。这是与沿用的通气搅拌式培养罐的区别所在。重组动物细胞——动物细胞培养装置(安瓿瓶)2．培养基和高密度发酵工程菌发酵有两条基本要求：使菌体生长良好，获得高浓度菌体(即高密度发酵)，才能得到最多的产物。一般的微生物发酵菌体干重：大肠杆菌125g/L；酿酒酵母145g/L。基因工程菌更高，一般达到200g/L。其次，发酵用培养基尽可能的简单，以便分离产物。使用合成培养基，包括葡萄糖、铵盐和无机盐等。使用尽可能廉价的维生素或氨基酸的营养缺陷型的工程菌。3．菌株和质粒的稳定性工程菌中的质粒的稳定性（传代）和质粒内在的稳定性很重要。质粒保存率高，相应地就会得到高浓度的产物。可利用质粒带氨苄青霉素等抗生素抗性标记。目前多采用两个以上的抗生素抗性标记的质粒，带有这种质粒的菌株在药物的存在下能够生长，反之则菌株则不能够生长。利用这种选择性，还可以对工程菌遗传稳定性进行检测。三、安全问题（一）重组DNA实验准则准则主内容：物理密封（P1～P4）和生物学密封（B1和B2）物理密封：将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。（实验设备、实验室设计、试验注意事项）生物学密封：用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主（如维生素或氨基酸营养缺陷型），同时用不能转移至其它活细胞的载体，通过这样组合的宿主载体系统，可以防止重组菌向外扩散。重组菌株外漏的可能性主要有：机械密封；接种；排气；取样；放罐等。培养装置能够防止重组体外漏和杂菌的侵入，并且能够密闭灭菌；尾气排除要有除菌装置，如果有气溶胶产生必须要有收集气溶胶的设备；发酵后的下游工作必须在密闭设备或者安全柜内进行。工业生产中重组菌培养的设备标准（LS1，LS2）(二)防止基因重组菌外漏的措施培养工程菌的外界条件至少要遵守物理密封(P1～P4)方法中的P1级规定。从生物安全性来考虑，常采用维生素或氨基酸营养缺陷型的工程菌。生产中，以下部分和操作均应采取一些措施，以防重组菌外漏：①排气；②机械密封；③取样；④培养后的灭菌；⑤接种；⑥放罐。企业中进行重组菌培养的设备标准有LS-1和LS-2。1.概念第三节动植物细胞的组织培养一、动物细胞培养动物细胞培养：将来自动物的某些器官或组织细胞，在模拟体内生理条件下进行体外培养使之存活和生长。（1975年后进入了新的阶段：基因工程细胞猴肾细胞产生生长激素1mg/d）。目前的单细胞状态培养早期的组织片培养2.动物细胞培养生产的药物类型目前利用动物细胞生产的药物有5大类：1）病毒疫苗。如脊髓灰质炎、狂犬病、乙型肝炎等疫苗。2）免疫调节剂。如干扰素、白细胞介素、胸腺素、转移抑制因子等。3）激素。如绒毛促性腺素、生长激素、促红细胞生成素等。4）人体活性蛋白。如胰岛素、血纤维蛋白溶酶原。5）药用酶。尿激酶、天门冬酰胺酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。动物胚胎幼龄动物器官细胞悬浮液10代细胞50代细胞原代培养传代培养（1）原代（初代）培养细胞：动物组织经过切碎、化学或酶处理得到的细胞，在培养期内（50代左右）其生长性状保持正常（一般20代左右的细胞可以作为种细胞冻存，生产疫苗、尿激酶和干扰素等）。3.动物细胞的性质（2）确立细胞株：原代培养的细胞经过反复分裂出现变异，能够在体外培养时无限制性得增殖，其形态遗传因子抗原性等都失去了原有的特性。（3）移植继代培养：用酶液处理的贴壁附着细胞可以分散为单层细胞，继续培养又可形成贴壁细胞（细胞株）。成纤维细胞与确立细胞株继代培养的细胞，经过几代反复分裂为成纤维细胞，大部分不具有癌化性，保留原代培养细胞的特性；到分裂至50代左右分裂停止，继而死亡；此过程中少部分发生变异为确立细胞株。确立细胞株：有无限增殖的繁殖特性（遗传物质发生改变），大多数情况下可以进行大量悬浮培养，但具有癌化性质。细胞来源：胚胎及成幼龄动物的组织器官单个细胞原代细胞细胞株细胞系剪碎胰蛋白酶分离细胞洗涤、稀释、分离原代培养传代培养遗传物质没有发生改变遗传物质发生改变动物细胞培养目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho（中华仓鼠卵巢）细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞)、Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。2.培养条件温度为37℃±0.5℃pH接近中性6.8-7.6，最适生长pH7.2-7.4，多数细胞对偏酸性的环境有耐受力；培养体系调节酸碱性利用CO2(NaHCO3)和细胞代谢产物组成的缓冲体系；气体：氧，二氧化碳，氮气；溶解氧的控制采用通气量和搅拌转速。目前常用的较多的是将硅氧管浸入培养液中，增加气液接触面。营养条件需要多种氨基酸，维生素，辅酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生长因子，其中多种成分可以由血清提供。1)实验室仪器和设备：常规的细胞培养设备：如CO2孵箱；培养器材：如培养瓶，纯水设备，干燥消毒除菌设备，清洗设备等。2)培养液：目前常用的基础培养液均已商品化，如RPMI1640，MEM，DMEM，F12等，可根据培养需求合理选择。细胞培养转瓶培养机3)血清：一般常用为小牛血清(包括胎牛血清)，人血清和其它动物血清。由于不同的研究目的，血清成分往往干扰研究实验，如进行药物和受体及营养等方面的研究时，需要使用无血清培养基。一、动物细胞培养4)平衡盐溶液：主要用于作为稀释和灌注的液体，维持细胞渗透压，提供缓冲系统，使培养液的酸碱度维持在培养细胞生理范围内，提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子等。常用的有PBS，Hank’s等。5)抗生素：常用为青霉素（每毫升培养液50~100单位）和链霉素（每毫升培养液50~100微克）。一、动物细胞培养6)其它添加成分：缓冲系统，常用为HEPES，缓冲效能(pKa)在20℃时为7.55，37℃为7.31；HEPES不是起维持pH恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速pH变化的，所以调整pH常常用NaHCO3溶液。有机补充物，如丙酮酸钠，谷胺酰氨等。促细胞分裂因子，如生长因子类的FGF(成纤维细胞生长因子)，EGF(表皮生长因子)。贴壁和铺展因子，如胶原蛋白，纤粘蛋白等。可根据培养细胞的特殊要求进行添加。一、动物细胞培养3.动物细胞培养特性除单细胞原生动物外，细胞培养过程具有以下特性：①细胞生长缓慢，易受微生物污染，培养时需用抗生素；②动物细胞较微生物大得多．无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差；③培养过程需氧量少，且不耐受强力通风与搅拌形成的较大流体剪切力；④在培养中，细胞相互粘连以集群形式存在，培养过程具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性及功能全能性；⑤产物分布于细胞内外，生产成本较高，但产品价格昂贵；⑥大规模培养时，不可照用微生物反应的经验；⑦原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡。4.动物细胞大规模培养的主要方法依细胞种类：原代培养传代培养依培养容器和方式：静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养中空纤维培养、固定床或流化床培养依培养基：液体培养固体培养从生产实际分为：悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养4.动物细胞大规模培养的主要方法(1)贴壁培养是必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。适用于一切贴壁依赖性细胞，也适用于兼性贴壁细胞。圆形的细胞一经贴壁就迅速铺展呈多种形态。此后细胞就开始有丝分裂并很快进入对数生长期。一般在数天后就铺满生长表面，形成致密的单层细胞。这种培养的方法又叫单层细胞培养。接触抑制：贴壁生长的细胞，当每个细胞与其周围的细胞互相接触时，细胞就停止增殖，长成单层的细胞。须在重新分散后，分瓶继续培养，才能继续分裂增殖，这叫传代。几个概念贴壁依赖性细胞：需要有适量带电荷的固体或半固体支持表面才能生长的细胞。大多数动物细胞都属于此类。非贴壁依赖性细胞：不依赖于固体支持物表面生长的细胞，可在培养液中悬浮生长，被称为悬浮细胞。举例：血液、淋巴细胞、肿瘤细胞和某些转化细胞，Namalwa细胞。兼性贴壁依赖性细胞：对支持物的依赖性不严格，既可贴壁生长，也可悬浮生长。举例：CHO细胞、BHK细胞、L929细胞。理想的药物生产细胞系贴壁培养的优点：●容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。●容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。●当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一种产品。●同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例。●适用于所有类型细胞。贴壁培养的缺点：操作麻烦，传代或扩大培养时需先消化，培养条件不易均一，传质和传氧较差。与悬浮培养法相比●扩大培养比较困难，投资大；●占地面积大；●不能有效监测细胞的生长；细胞贴壁的表面：要求具有净阳电荷和高度表面活性。对微载体而言还要求具一定电荷密度；若为有机物表面，必须具有亲水性，并带阳电荷。贴壁培养系统：主要有转瓶、中空纤维（后面专题介绍）、玻璃珠、微载体系统（后面介绍）等。转瓶培养系统：培养贴壁依赖型细胞最初采用转瓶系统培养。转瓶培养一般用于小量培养到大规模培养的过渡阶段，或作为生物反应器接种细胞准备的一条途径。细胞接种在旋转的圆筒形培养器-转瓶中，培养过程中转瓶不断旋转，使细胞交替接触培养液和空气，从而提供较好的传质和传热条件。优点：结构简单，投资少，技术成熟，重复性好，放大