2009期末考试论文格式及参考模板

论文格式要求一、页面设置纸型：A4纸型上下边界：25mm左右边界：25mm行距：固定值24磅字体：宋体字号：标题四号加粗，正文五号页码：暂不设置页码二、论文格式************（中文题目，一般不超过20个字）院系名称（小四号黑体）作者姓名（小四号楷体）指导老师的姓名和职称：请在学生作者的署名下方另起一行注明。摘要（五号黑体）：*****************************（中文，五号仿宋。摘要是科研论文主要内容的简短、扼要的重述，必须表达论文本身新的、最具特色的内容，重点是结果和结论；.一般以第三人称的语气写，避免用“本文”、“我们”、“本研究”等作为文摘的开头。）关键词（五号黑体）：***************************（中文，五号仿宋，一般选取3～8个词，每个词之间应留有空格以区别之。）正文（五号宋**********************************************************************************************************************************************************************************************说明：①文内必要的解释性说明词语可采用“注释”形式，其序码以圆括号放在加注处右上角，内容排在加注处所在页的页下，页下注序码每页单独排序。②表格设计必须清晰、规范，每个表格除有栏头、表身外还应在表的上方居中标明表序和表题，中间空一格将两者分开；表随文放，一般应列在“见表×”文字的自然段落的下面，在正文中要明确提及见表×；表格一般采用三线表。③插图要求大小比例适中，数字清晰，照片黑白对比分明；图也应随文字放在“见图×”文字的自然段落下面；每幅图都要有图序和图题，通常写在图的下方居中位置。④论文内各大部分标题用“一、二┅┅”，次级标题为“（一）、（二）┅┅”，三级标题用“1、2┅┅”，四级标题用“（1）、（2）┅┅”。不再使用五级以下标题。参考文献（黑体五号，在正文后居中排版）参考文献是期刊时为〔序号〕著者.题名[J].期刊名，出版年份，卷号(期号):页码.参考文献是图书时为〔序号〕著者.书名[M].版次.出版地:出版社,出版年份.页码.*************（英文题目，小四号TimesNewRoman）Abstract:******************************************************************************************************************************KeyWords:****；****；****附：医科论文格式样板参照人纤溶酶原K5基因与真核表达载体pPICZA重组体的构建光华口腔学院陈素洁指导教师蔡卫斌高国全摘要:以K5/pET22b（+）为模板用PCR的方法扩增人纤溶酶原kringle5基因，并用XbaI和EcoRI双酶切目的基因和真核表达载体pPICZA，胶回收试剂盒纯化酶切产物，用DNAT4连接酶连接目的基因和载体构建重组体K5/pPICZA，并转化进大肠杆菌DH5，筛选阳性菌落，PCR鉴定重组体K5/pPICZA，为人纤溶酶原K5在真核系统中表达提供基础性研究。关键词:人纤溶酶原;kringle结构;基因克隆新生血管的生成为恶性肿瘤生长提供营养，也是恶性肿瘤转移的必要条件，抑制新生血管在一定程度上可以减缓肿瘤细胞的恶性扩增，因此，基于抑制血管生成的治疗成为肿瘤治疗的热点。1994年,O`Reilly等人从荷瘤小鼠的尿液和血清中分离纯化得到血管生成抑制素(angiostatin),它与人纤溶酶原kringle1～4功能区有同源性,具有抑制毛细血管内皮细胞增殖、抑制血管生成和转移瘤生长的生物活性[1]。动物试验研究还表明,血管生成抑制素对纤维肉瘤细胞株、人乳腺癌、结肠癌、前列腺癌细胞株在小鼠体内形成的肿瘤也有很强的抑制作用[2]。最近,Gao等[3]发现人纤溶酶原的kringle5功能区有比angiostatin更强的抑制内皮细胞生长的活性。本课题在已获得原核体系中表达的活性K5蛋白基础上，进一步构建K5/pPICZA重组体，以期在真核表达体系中获得有活性K5蛋白。一、材料和方法（一）材料含K5/pET22b（+）重组体的E.coliBL21(DE3)为本室构建并保存；EcoRI和XbaI为NewEngland公司产品；酵母粉、胰蛋白胨为OXIOD公司产品；IPTG购自北京鼎国生物技术公司；抗生素zeocin为Sigma公司产品，pfuTagDNA聚合酶和质粒pPICZA均购自invitrogen公司，DNA胶回收试剂盒购自NOVAGEN公司，其他试剂为分析纯；引物由赛百盛公司合成。（二）聚合酶链反应（PCR）扩增K5基因以K5/pET22b（+）重组体为模板，上游引物为：5`-CGAATTCCCAGATGTAGAGACTCCTTC-3`，5`端设计有EcoRI的酶切位点；下游引物为：5`-CTCTAGAGCGGCACACTGAGGGACATCACA-3`，5`端设计有XbaI的酶切位点，建立PCR反应体系：ddH2O38l，10pfuBuffer5l，4dNTPs4l，K5primer(+)0.7l，K5primer(-)0.8l，K5/pET22b（+）1l，pfuTagDNA聚合酶0.5l。混匀后，进行PCR反应，反应条件：95℃预变性3m，95℃变性80s，54℃复性100s，72℃延伸2m，循环30次，72℃延伸10m。扩增完毕后，取样5l，于1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳，检测是否有扩增产物K5基因。（三）K5基因和载体的酶切及酶切产物的纯化PCR产物K5DNA片段经酚/氯仿抽提、乙醇沉淀纯化后，用EcoRI和XbaI两种酶同时消化，质粒pPICZA同样用EcoRI与NotI进行双酶切，双酶切体系组成：ddH2O39.5l，10Buffer5l，100BSA0.5l,DNA2g,EcoRI1.0l,XbaI1.0l，总体积50l。酶切产物按照DNA胶回收试剂盒操作方法进行纯化，纯化产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，用Genegenuis凝胶分析系统进行DNA相对定量。（四）重组体的构建及转化纯化后的产物在T4DNA连接酶作用下进行连接反应，反应体系：K5DNA8l，pPICZA1.0l，Buffer2.0l，T4DNALigase1.5l，ddH2O6.5l，总体积20l。反应液于16℃水浴反应18小时，置于4℃待转化。然后导入感受态的大肠杆菌DH5（感受态细胞的制备参见《分子克隆》），涂布于含25g/mlzeocin抗生素的LB板上，37℃过夜培养。（五）阳性菌落的筛选及鉴定挑取LB平板上单克隆菌落，接种于无菌含25g/mlzeocin的LB培养基，过夜培养。参照《分子克隆》中质粒DNA提取方法抽提培养物的质粒DNA，TE溶解DNA，于-20℃保存。以抽提DNA为模板，引物和PCR体系同前，鉴定菌落DNA中是否存在目的基因，初步判定重组体构建成功与否。二、实验结果（一）PCR反应获得目的基因K5片段通过PCR反应获得K5基因片段，1.0%琼脂糖凝胶电泳示目的基因大小约为288bp（如图1所示，含设计的双酶识别序列），与理论推测的基因片段大小一致。图1.PCR反应扩增目的基因1~7：PCR扩增的目的基因片段；M：标准分子量DNA片段（二）K5基因和pPICZA载体双酶切产物的纯化和定量目的基因K5和载体pPICZA经EcoRI和XbaI消化后，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳和胶回收试剂盒纯化酶切产物（如图2A），并电泳鉴定纯化后的产物，Genegenius凝胶分析系统对DNA进行相对定量示：K5为14.7ng/l,pPiczA为29.4ng/l。图2.目的基因与载体双酶切及酶切产物纯化与相对定量A：酶切前后；B：酶切产物纯化后鉴定；1：酶切前载体pPICZA；2：酶切后PCR产物；3：酶切后载体pPICZA；4：PCR酶切产物纯化后；5：载体酶切产物纯化后；M：标准分子量1100bp200bp300bp400bp500bp600bp700bp800bp900bp1038bp289bp1234567MAB234M5100bp200bp300bp400bp500bp600bp700bp800bp900bp1038bpDNA片段（三）PCR鉴定阳性菌落转化菌接种含有25g/mlzeocin的LB平板后，有单克隆菌落产生，挑取菌落扩增培养抽提质粒DNA，以其为模板PCR鉴定含重组体菌落（如图3）：从重组菌质粒DNA中能扩增出目的基因片段，大小与从阳性K5/pET22b（+）扩增出的目的基因相一致，而以空载体为模板则不能扩增出目的片段。图3.SDS-PAGE分析重组转化菌株表达产物1：阳性模板K5/pET22b（+）扩增产物；2：重组菌质粒DNA扩增产物；3：质粒pPICZA扩增产物；M：DNA分子量标准三、讨论人纤溶酶原kringle5功能区具有抑制毛细血管内皮细胞增殖、迁移的作用[3，4],这是血管形成过程的两个关键步骤，推测人纤溶酶原kringle5功能区可能具有抑制血管形成和肿瘤生长的特性。本课题组已获得从原核体系中表达的活性K5蛋白，但对其活性是否受细菌内毒素的影响及其天然构象是否发生改变尚不清楚。本实验是前期工作的基础上，构建K5与真核表达载体pPICZA的重组体，为下一步的K5真核表达体系的建立提供给出行研究。人纤溶酶原的Kringle5功能区约由91个氨基酸组成，编码该蛋白的基因约有289bp。本实验首先用PCR的方法从K5/pET22b（+）扩增出目的基因，其大小理论推算一致。目的基因和载体pPICZA均用EcoRⅠ和XbaI两限制性核酸内切酶酶切，产物纯化后进行连接反应，并转化进宿主菌DH5，挑选单克隆菌落，PCR方法能从重组菌中扩增出目的基因片段，初步鉴定了K5/pPICZA重组体，为后续工作提供基础。参考文献[1]O`reillymS,HolmgrenL,ShingY,etal.Angiostatin:anovelangiogenesisinhibitorthatmediatesthesuppressionofmetastasesbyaLewislungcarcinoma[J].Cell,1994,79:14.4kD123M100bp300bp500bp700bp目的基因315-328.[2]O`reillymS,HolmgrenL,ChenC,etal.Angiostatininducesandsustainsdormancyofhumanprimarytumorsinmice[J].NatMed,1996,2:689-692.[3]ZhangD,KaufmanPL,GaoG（高国全）,etal.Intravitrealinjectionofplasminogenkringle5,anendogenousangiogenicinhibitor,arrestsretinalneovascularizationinrats.Diabetologia2001Jun;44(6):757-65.[4]GaoG（高国全）,LiY,GeeS,etal.Down-regulationofvascularendothelialgrowthfactorandup-regulationofpigmentepithelium-derivedfactor:apossiblemechanismfortheanti-angiogenicactivityofplasminogenkringle5.JBiolChem2002Mar15;277(11):9492-7.Construction