生物化学实验操作手册

1总论目录第一篇生物化学实验基本操作、基本技术及原理...............6第一章生物化学实验基本操作.............................................6第二章实验样品的制备.......................................................13第三章分光光度法..................................................................15第四章层析法...........................................................................19第五章电泳法...........................................................................29第二篇基础生物化学实验......................................................36实验一蛋白质的定量测定——Folin-酚法.....................36实验二SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)...........42实验三酵母核糖核酸（RNA）的提取...........................51实验四酵母核糖核酸（RNA）组分的鉴定..................53实验五核酸的定量测定——紫外(UV)吸收法................57实验六过氧化氢酶米氏常数（Km）的测定...................59实验七维生素C的定量测定（2.6-二氯酚靛酚滴定法）............................................................................................................63实验八小麦萌发前后淀粉酶活力的比较.........................70实验九血糖的定量测定（GOD-PAP法）73221世纪是生命科学的世纪,生物化学与分子生物学是当代生命科学领域中一门重要的基础学科,它涵盖的基础理论,基本知识,基本技术与医学研究各学科领域密切相关,其理论与技术的发展,推动了生命科学的发展,对人类的科技进步与文明产生巨大影响。生物化学实验是医学院校学生必修的一门独立的基础实验技术课程，其研究技术的发展与应用是依据物理学、化学及生物学的基本理论和实验方法而建立起来的。20世纪20年代微量分析的发展，30年代电子显微镜的出现，40年代层析技术和电泳技术的兴起，以及同位素示踪技术、各种光谱技术、核磁共振技术的应用，激光、超导等新技术的出现，电子计算机技术的突飞猛进，使生物化学实验手段提高到一个崭新的水平，掌握生物化学实验方法和研究技术，对医学院校学生来说是十分重要的。本门课程主要侧重于给学生以基本的实验方法和技能的训练，让学生了解并掌握生物化学的四大基本实验方法，即：分光光度法、离心法、层析法和电泳法。同时也注意引进一些新近发展起来的、重要的生物化学及分子生物学研究技术，作为学生学习其他专业课程和进入科学研究领域的准备。一、实验要求1．实验前必须预习实验指导和有关理论，明确实验目的、原理、预期的结果，操作关键步骤及注意事项。2．实验时要严肃认真专心进行操作，注意观察实验过程中出现的现象和结果，结果不良时，必须重做。33．实验中，应及时将实验结果如实记录下来，并请老师当场审核。根据实验结果进行科学分析，按时将实验报告交教师评阅。二、实验时注意事项1．进实验室要穿好实验服，以免酸碱腐蚀衣服。2．进实验室前准备好实验指导、课本、笔记、实验记录本、报告本、文具等。3．要保持实验台整洁，试剂、仪器应整齐,按次序放置。实验完毕要按各类仪器的清洗方法和要求将仪器清洗干净。4．实验室是培养学生独立思考、独立工作能力及良好科学作风的重要场所，操作务必认真不得敷衍，室内应保持肃静，不得吸烟、玩闹，不得随地吐痰，乱丢纸屑。实验后要清扫实验台面、地面、试剂瓶要码放整齐。5．要爱护仪器、节约药品。第一次实验时要按仪器清单清点仪器，负责保管，用后如数交还,在使用时如有破损，及时报告，经指导教师检查后填写破损单，按学校规定赔偿。6．贵重仪器，如分光光度计、离心机等，要尽力爱护，使用前应熟悉使用方法，严格遵守操作规程，严禁随意开动。7．要节约水电，一经用完随手关闭水门、电门。三、值日生任务1．领发本次所用仪器、物品，清点、交还临时用仪器、物品，若有损坏负责追查赔偿。2．管理操作公用仪器，打蒸馏水。43．搞好实验室卫生，做到仪器、桌面、地面、水池……全干净。4．确保安全：管好仪器、门窗、水电。5．请任课及技术室老师检查工作，认可后方能离开实验室。四、试剂使用规则1．使用试剂前应仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需要。2．取出试剂后，立即将瓶塞盖好，切勿盖错，放回原处。试剂瓶塞、专用吸量管、滴管，不得与试剂瓶分家，以免错用而污染试剂，造成自己或他人实验的失败。未用完的试剂不得倒回瓶内。3．取标准溶液时，应先将标准液倒入干净试管中，再用清洁吸管吸取标准液，以免污染瓶中的标准溶液。4．使用滴管时，滴管尖端朝下，切勿倒置，勿使试剂流入橡皮帽内。5．使用有毒试剂及强酸强碱时，尽可能用量筒量取，若用吸管时只能用吸耳球吸取，切勿用嘴吸取，以免造成意外。五、安全注意事项1．低沸点有机溶剂，如乙醚、石油醚、酒精等均系易燃物品，使用时应禁明火、远离火源，若需加热要用水浴加热，不可直接在火上加热。2.凡属发烟或产生有毒气体的化学实验，均应在通风柜内进行，以免对人体造成危害。3．若发生酸碱灼伤事故，先用大量自来水清洗，酸灼伤者用饱5和NaHC03溶液中和，碱灼伤者用饱和H3B03溶液中和，氧化剂伤害者用Na2S204处理。4．若发生起火事件，根据发生起火性质分别采用砂、水、C02或CCl4灭火器扑灭。5．离开实验室必须关好窗户，切断电源、水源，以确保安全。六、废弃物处理1．所有固体废弃物如：用过的滤纸、棉花、碎屑沉淀物等必须倾弃于垃圾筒中。2．浓酸必须弃于小钵中，用水稀释后倒入水池中。3．实验完成后之沉淀或混合物含有可提取之贵重药品者不可随意舍弃，应交教师保存。6第一篇生物化学实验基本操作、基本技术及原理第一章生物化学实验基本操作【玻璃仪器的洗涤与清洗】生物化学实验常用各种玻璃仪器，其清洁程度将直接影响实验结果的可靠性。因此，玻璃仪器的清洁不仅是实验前后的常规工作，而且是一项重要的基本技术。玻璃仪器的清洗方法很多，需要根据实验的要求，以及污物性质选用不同的清洁方法。1．新购仪器的清洗新购仪器表面附着油污和灰尘，特别是附着有可游离的金属离子。因此，新购仪器需要用肥皂水刷洗，流水冲净后，浸于10％Na2CO3溶液中煮沸。用流水冲净后，再浸泡于1％～2％HCl溶液中过夜。流水洗净酸液，用蒸溜水少量多次冲洗后，干燥备用。2.使用过的玻璃仪器的清洗(1)一般非计量玻璃仪器或粗容量仪器，如试管、烧杯、量筒等先用肥皂水刷洗，再用自来水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗2～3次后，倒置于清洁处晾干。(2)容量分析仪器，如吸量管、滴定管、容量瓶等，先用自来水冲洗，沥干后，浸于铬酸洗液浸泡数小时。然后用自来水和蒸馏水冲洗干净，干燥备用。7(3)比色杯，用毕立即用自来水反复冲洗，如有污物粘附于杯壁，宜用盐酸或适当溶剂清洗。然后用自来水、蒸馏水冲洗干净。切忌用刷子、粗糙的布或滤纸等擦试。洗净后，倒置晾干备用。【吸量管的种类和使用】吸量管是生化实验最常用的仪器之一，测定的准确度和吸量管的正确选择和使用有密切关系。1．吸量管的分类常用的吸量管可以分为三类：（1）奥氏吸量管供准确量取0.5、1.0、2.0、3.0ml液体所用。此种吸量管只有一个刻度，当放出所量取的液体时，管尖余留的液体必须吹入容器内。（2）移液管常用来量取50ml、25ml、10ml、5ml、2ml、1ml的液体，这种吸量管只有一个刻度，放液时，量取的液体自然流出后，管尖需在盛器内壁停留15秒钟，注意管尖残留液体不要吹出。（3）刻度吸量管供量取1Oml以下任意体积的溶液。一般刻度包括尖端部分。将所量液体全部放出后，还需要吹出残留于管尖的溶液。此类吸量管为“吹出式”，吸量管上端标有“吹”字。未标“吹”字的吸量管，则不必吹出管尖的残留液体。8图1．1．1三类吸量管简图l、2刻度吸量管3奥氏吸量管4移液管2．吸量管的使用(1)选用原则准确量取整数量液体，应选用奥氏吸量管。量取大体积时要用移液管。量取任意体积的液体时，应选用取液量最接近的吸量管。如欲取O.15ml液体，应选用0.2ml的刻度吸量管。同一定量试验中，如欲加同种试剂于不同管中，并且取量不同时，应选择一支与最大取液量接近的刻度吸量管。如各试管应加的试剂量为0.30、0.50、0.70、0.90ml时，应选用一支1.0ml刻度吸量管。(2)吸量管的使用使用吸量管时，用拇指和中指夹近顶端部分，将管的下端插入液体，用吸耳球吸入液体到需要刻度标线上1～2cm处（插入液面下的部分不可太深，也不可太浅，防止空气突然进入管内，将溶液吸入吸耳球内），用食指封闭上口将已充满液体的吸量管提出液面，把吸量管提到与眼睛同一水平线上，然后小心松开上口，调节液面至需要的刻度处。将吸量管移到另一容器，松开上口，使液体自由流出。最后再根据规定吹出或不吹出尖端的液体。9图l.l.2放液体时的姿势3．可调式移液器的使用1）可调式移液器的结构图l.l.3可调式移液器的结构图l.l.4持移液器的姿势注：推动按钮内部的活塞分2段行程，第一档为吸液，第二档为放液，手感十分清楚。2)可调式移液器的操作10a．调节轮至所需体积值；b．套上吸头，旋紧；c．垂直持握可调式移液器用大拇指按至第一档；d．将吸头插入溶液，徐徐松开大拇指，使其复原；e．将可调式移液器移出液面，必要时可用纱布或滤纸拭去附于吸头表面的液体(注意：不要接触吸头孔口)；f．排放时，重新将大拇指按下，至第一档后，继续按至第二档以排空液体。注意：移取另一样品时，按卸尖按钮弃掉吸头并更换新吸头。【混匀】样品和试剂的混匀是保证化学反应充分进行的一种有效措施。为使反应体系内各物质迅速地接触，必须借助于外力的机械作用。常用的混匀方法有以下几种：1.旋转法：手持容器，使溶液作离心旋转。适用于未盛满液体的试管或小口器皿如锥形瓶。2.指弹法：一手执试管上端，另一只手轻弹试管下部，使管内溶液作旋涡运动。3.搅动法：使用玻璃棒搅匀，多用于溶解烧杯中的固体。4．电磁搅拌混匀115.混匀器法：将容器置于混匀器的振动盘上，逐渐用力下压，使内容物旋转。注意：混匀时谨防容器内液体溅出或被污染；严禁用手堵塞管口或瓶口振摇。【保温】将容器放入恒温水浴箱，调节温度设定钮至所需温度。水浴箱中水分要充足，实验过程中要随时监测温度，并及时调节。【过滤】用于收集滤液，收集沉淀或洗涤沉淀。在生化实验中如用于收集滤液应选用干滤纸，不应将滤纸先弄湿，湿滤纸将影响滤液的稀释比例。滤纸过滤一般采用平析法(即对折后，再对折)并且使滤纸上缘与漏斗壁完全吻合，不留缝隙。向漏斗内加液时，要用玻棒引导而且不应倒入过快，勿使液面超过滤纸上缘。较粗的过滤可用脱脂棉或纱布代替滤纸。有时以离心沉淀法代替过滤法可达到省时、快捷的目的。【离心沉淀法】欲使沉淀与母液分开，过滤和离心都可以达到目的，但是当沉淀粘稠，或颗粒小得可以通过滤纸时，则需选用离心法。特别是溶液量小又需定量测定时，离心分离法更具优越性。离心分离是利用离心力将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，借以分离比重不同的各种物质成分的方法，是实验室常规采用的技术。离心机种类很多，转速少于6000r/min的为低速离心机；转速低于25000r/min的为高速离心机；转速超过30000r/min的为超速离心12机。根据离心机的用途不同，还可以将离心机分为分析离心机和制备离