农杆菌注射烟草转化

农杆菌注射烟草实验步骤农杆菌转化1.取1µl质粒加入50µl刚冻解的农杆菌感受态中（提前准备1mlLB培养液，1.5ml灭菌管，电击杯，移液枪，枪尖等）。★感受态易失效，准备工作须充分2.吸取菌液打入电击杯，（不要产生气泡），放入电击仪（调manal至1.6-1.7）。3.电击完立即加入1mlLB培养基，混匀，并吸至新的离心管中。4.28℃，摇2h（过程中可以准备抗性板子，或提前准备）。5.涂板，（使用kan+rif双抗板）28℃培养36h。6.可做菌落PCR检测是否转化成功，同时做菌种保藏（根据实验需要）。接菌注射1.挑菌转接3ml双抗培养基，27℃摇菌过夜。★玻璃试管摇菌效果要好些2.取20µl菌液到20mlLB培养基中，（20mlLB+100ml/LMES+20µmol/LAS+500µlkana/L）摇菌过夜至OD值为1.0-1.5。●不加Rif★准备两份，最后调OD值会用到。3.3560r/min,10min弃上清。4.配缓冲液MMA（H2O+MES10ml+MgCl210ml+AS1ml）,现配现用。用等量缓冲液重悬菌液。一份等量，一份少量5.调菌液OD值至1.0，室温放置1h。将需要混合的菌液等体积混合，可注射。电击杯用完在水中泡一泡，再用75％酒精冲洗，存放在75%酒精中，下次使用前取出晾干。母液配制：MES1mol/L称取一定量的MES固体溶于小烧杯中用去离子水溶解,调节PH至5.6。●溶液完全溶解才可测PH★MES难溶，加KOH结合磁力搅拌器有助于溶解MgCl21mol/LAS过滤灭菌：注射器先吸取待灭菌液体,插入滤芯,插紧,将液体悬空打入无菌容器,将滤芯放回。★全过程不污染滤芯