6拮抗细菌对烟草花叶病毒（TMV）的抑制作用研究Thes

6.拮抗细菌对烟草花叶病毒（TMV）的抑制作用研究申莉莉王凤龙钱玉梅陈德鑫吴惠惠何京美（中国烟草总公司青州烟草研究所）摘要：从发生TMV的烟田耕作层土样中分离到对TMV有拮抗作用的菌株33、88。半叶法生测试验表明，菌株33、88的发酵培养液对TMV的体外抑制作用分别为98.28%、92.81%，涂抹菌液6h后接种，仍有78.6%、55.81%的预防作用。硫酸铵沉淀无菌发酵液、PBS透析获得拮抗蛋白，对TMV的体外抑制作用分别为85.38%、87.47%，并且在274.00nm处有明显的蛋白吸收峰，为典型的蛋白质吸收光谱。此外，通过叶圆片法和透析法生测表明：抗病毒蛋白与TMV粒子结合作用为不可逆，有抑制TMV在烟株体内复制的作用。关键词：抗病毒蛋白生物防治烟草花叶病毒ThestudyofresistanceofantagonisticbacteriatoTMVShenLiliWangFenglongQianYumeiChenDexinWuHuihuiHeJingmeiTobaccoresearchinstituteofCAAS,Qingdao266101Abstract：Thisarticleresearchedtheantagonisticbacteriaisolatedfromthesoiloftobaccofield.Itwasshowedthatthezymosisfluidhadbetterpassivation,thecontrolwere98.28%、92.81%respectively,andgoodprevention,thecontrolwere78.6%、55.81%respectively.Theantagonisticproteinobtainedbyvitriolin-ammoniumdepositionhadthecontrolof85.38%、87.47%toTMV,andithadabsorbapexin274vnm.ThestudyalsoshowedthatthelinkofbetweenantagonisticproteinandTMVwasun-reversible,andcouldrestrainthecopyofTMVintobacco.Keywords:ProteinresistancetoTMVBiologicalcontrolTMV病毒病是作物上的重要病害，因该病发生引起重大损失的情况时有发生，仅我国烟草由病毒病发生引起的损失每年在5亿元左右[1]。由于植物病毒的绝对寄生性，其生命周期过程需要寄主细胞能量、酶系统的参与，病毒病的防治是世界性的难题。微生物是自然界中一类丰富的资源，微生物之间的拮抗作用广泛存存在，是生物农药研制的依据之一。从中筛选生防菌株，获得抗病毒蛋白和抗病毒基因，明确作用机制，研制微生物农药；把微生物源抗病毒基因转入植株，获得抗性品种，是有效策略。1材料与方法1.1试验材料从烟田耕作层（5cm~15cm）土样，分离到对TMV有拮抗作用的菌株by33、by88。供试烟草品种为三生-NN烟（Nicotianatabacumvar.SamsumNN）、NC89。1.2无菌发酵液、蛋白粗提液的制备[2]挑取纯化菌落，在50ml/250ml液体培养基中，28℃、120r/min振荡培养2d，8000r/min离心20分钟，细菌过滤器（0.25цm）去菌体，得无菌滤液。取100ml无菌发酵液在冰水浴中，缓慢加入80%饱和度硫酸铵56.1g，缓慢搅拌10~30min，4℃静置过夜，8000r/min、4℃离心20min，沉淀用2倍体积的PBS缓冲液溶解，上清和沉淀分别置于透析袋中（MW：8000-14400），PBS透析2d，得粗蛋白提液、去蛋白上清液。半叶法检测活性。挑选大小均匀的5-8片叶烟株，每处理3-4重复，每重复3株，以下生测处理接种方法雷同。左侧：待测液体与等体积80倍TMV汁液混合；右侧：80倍TMV汁液与等体积无菌水混合。分别测上清和沉淀的拮抗活性。以不接菌发酵培养液为对照。1.3粗提蛋白的吸光值测定[3、4]粗提蛋白液稀释后，在MultiskanSpectrum上，以220-340nm近紫外波段扫描并记录吸光度。1.4拮抗物质与TMV的作用方式[5]体外钝化作用：TMV与无菌发酵液混合后15min，半叶法接种三生烟；预防作用：先左侧叶涂抹无菌发酵液，右侧涂抹水，6h后整叶接种TMV；治疗作用：先整叶接种TMV，6h后，左侧涂抹无菌发酵液，右侧涂抹水。1.5拮抗物质对病毒体内复制作用的测定叶圆片法[6]：TMV接种在系统寄主NC89上6h后，取直径为15mm的圆片叶，分别在蒸馏水、粗提蛋白液中漂浮，48h后，研磨、离心，接种三生烟。1.6拮抗物质与TMV的结合方式测定透析法[7]：TMV与粗提蛋白液混合30min，流水透析3d；TMV与粗提蛋白液混合后4℃静置3d；对照为TMV透析3d。半叶法接种三生烟，记录枯斑数。2结果与分析2.1粗提蛋白液对TMV体外钝化作用表1无菌发酵液、粗提蛋白液对TMV活性检测（单叶平均枯斑数）粗提蛋白液33上清33粗提蛋白液88上清88不接菌处理重复13.9240.041.262.96.7541.1330.2544.8820.6710.67重复26.1729.2537.454.25.7532.1337.6349.3827.6736.67重复35.038.2526.434.16.043.3853.8854.6340.3365.67重复43.9122.4535.356.83.055.1425.030.549.3341.33平均4.7532.4935.0652.05.3842.9536.6944.8534.538.59防效85.38%32.58%87.47%18.22%10.60%硫酸铵沉淀法获得的粗提蛋白液对TMV的体外钝化作用分别为85.38%、87.47%，而上清液和不接菌处理对TMV钝化作用微弱，说明活性物质的主要成分为蛋白质类。2.2粗提蛋白的吸光值测定图1by33粗提蛋白液的吸光值Peaks:274nm0.880\33蛋白液.gphPeaks:274nm0.224\33去蛋白液上清.gph图2by88粗提蛋白液的吸光值Peaks:274nm0.822\88蛋白液.gphPeaks:274nm0.216\88去蛋白液上清.gph粗提蛋白液在近紫外光220-340nm的吸光值测定结果表明：抗病毒活性物质在274nm处有明显的蛋白吸收峰，为典型的蛋白质吸收光谱。此外，上清液的扫描图谱和蛋白液扫描图谱形状一样，且274nm同样存在吸收峰，但吸光值较小，是由于硫酸铵沉淀的浓度不佳未能全部沉淀的结果。2.3拮抗物质与TMV的作用方式表2拮抗物质与TMV作用方式（单叶平均枯斑数）作用方式体外钝化作用治疗作用预防作用By33By88By33By88By33By88重复10.2568.753.7533.014.018.59.022.751.675.3312.3322.67重复20.7542.252.546.544.2563.012.2514.250.672.02.3312.0重复31.640.43.028.2512.519.758.6710.330.56.03.05.33重复4--1.845.814.523.75------平均0.8750.472.7638.3921.3131.259.9715.780.954.445.8913.33防效98.28%92.81%31.81%36.82%78.60%55.81%通过无菌发酵液与TMV混合后接种、先接种后涂抹发酵液、先涂抹发酵液后接种，三种方式的枯斑数记录结果显示：无菌发酵液对TMV有较好的体外钝化作用，作用效果分别为98.28%、92.81%，也具有一定的预防作用，但治疗作用微弱。2.4拮抗物质对病毒体内复制的抑制作用表3叶圆片法测定拮抗物质对TMV体内复制的抑制作用（单叶平均枯斑数）悬浮在粗提液33悬浮在蒸馏水悬浮在粗提液88悬浮在蒸馏水重复15.838.834.444.0重复26.8317.53.434.2重复310.518.671.8315.5重复45.020.0平均7.0416.253.2131.23防效56.68%89.72%TMV接种NC89系统寄主6h后，取叶圆片，悬浮于粗提蛋白液48h后，接种显示：在粗提液中悬浮的圆片，比在蒸馏水中悬浮，研磨接种，枯斑数分别降低55.69%，89.19%，说明拮抗物质有抑制病毒体内复制的作用。2.5拮抗物质与TMV的结合方式表4粗提蛋白液与TMV结合方式的测定33+TMVTMV透析33+TMV，透析TMV透析88+TMVTMV透析88+TMV，透析TMV透析重复126.0110.754.7559.7514.3336.3336.068.0重复213.567.020.2586.2519.053.031.053.0重复313.7564.026.8105.423.2580.519.853.2平均17.5880.5817.2783.818.8656.6128.9358.07防效77.97%79.39%66.68%50.18%粗提蛋白液33（88）与TMV混合后，经过透析处理，其抑制效果为79.39%（50.18%），与未经透析的抑制效果77.97%(66.68%)相当，说明拮抗物质与TMV的结合方式是不可逆的结合，透析不能还原TMV与拮抗物质的这种结合作用。3讨论病毒病是烟草生产上的重要病害，除了在生育期控制虫媒传播外，筛选有效的抗病毒制剂和选育抗病毒品种，也是病毒病防治的重要环节。病毒病的微生物防治是具有发展潜力的重要防治手段，微生物间的拮抗作用很普遍，但关键是要筛选稳定、高效的拮抗物质，寻找抗病毒育种的抗原，才能为制备生物农药、抗病毒育种打下基础。Mulvania于1926年就发现被细菌污染的植物病毒汁液很快丧失侵染活力。本试验从烟田土样中筛选出对TMV有拮抗作用的菌株33、88，其分泌的抗病毒蛋白经过室内生测和作用方式的初步分析，能有效的钝化TMV粒子，抑制病毒的体内复制，具有研究价值。但有关菌株及其分泌抗病毒蛋白的特性，及其与TMV在烟株体内的作用机制，仍需进一步研究。参考文献[1]王利国.马祁.天然产物对植物病毒的抑制作用.中国生物防治.2000，16（3）：127~130[2]郑爱萍.李平.王世全等.水稻纹枯病拮抗菌B34分离鉴定及杀菌蛋白的获得.中国水稻科学.2002,16(4):356~360.[3]KobayashiN.HiramastruA.AkatukaT.PurificationandchemicalpropertiesofaninhibitorofplantvirusinfectionfromfruitingbodiesofLentinusedodes.AgriculturalandBioloficalChemistry.1987,51(3):883~890.[3]吴元华.朱春玉.王春梅等.嘧肽霉素对烟草花叶病毒病抑制作用研究.植物保护.2005，31（4）：52~54.[4]沈同王镜岩.生物化学(第二版).高等教育出版社.1999年.p87.[5]付佳鸣.吴祖建.林奇英等.金针菇中一种抗病毒蛋白纯化及其抗烟草花叶病毒特性.福建农林大学学报.2003，32（1）：84~88[6]孙慧.吴祖建.谢联辉等.杨树菇(Agrocybeaegerita)中种抑制TMV侵染的蛋白质纯化及部分特性.生物化学与生物物理学报.2001,33(3):351~354.[7]付鸣佳.林健清.吴祖建等.杏鲍菇抗烟草花叶病毒蛋白筛选.微生物学报.2003,43(1):29~34.附：半叶法接种三生-NN烟（Nicotianatabacumvar.SamsumNN）照片。图1为菌株BY33的发酵液，接种4d后的枯斑症状(上：病毒汁液80X+等体积细菌发酵液；下：病毒汁液80X+等体积无菌水)图2为菌株BY88的发酵液，接种4d后的枯斑症状