9拮抗细菌对烟草青枯病的温室防病及促生效果

9.拮抗细菌对烟草青枯病的温室防病及促生效果*王静12,赵廷昌1**,孔凡玉2,何月秋3,张成省2,刘建华4,刘伟成4（1中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室北京1000942中国农业科学院烟草研究所青岛2661013云南农业大学植物保护学院昆明6502014北京市农林科学研究院植物保护环境保护研究所北京100089）WangJing1,2,ZhaoTing-chang1,KongFan-yu2,HeYue-qiu3,ZhangCheng-sheng1,LiuWei-cheng4,LiuJjian-hua4(1；ThestateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,CAAS,Beijing100094,China2TobaccoResearchInstituteofCAAS,QingDao266101，China;3.PlantProtectionCollage，YunnanAgriculturalUniversity，Kunming650201,China4InstitudeofPlantandEnvironmentProtection,BeijingAcademyofAgricultureandForestrySciences,Beijing100089,China）摘要：本实验针对从福建、贵州两省烟草青枯病流行区烟株根围土样筛选得到的对青枯病有较好拮抗作用的细菌菌株，测定了其温室防效和促生作用；结果表明，在室内对青枯病菌抑制作用较强的菌株，并不都对烟草青枯病有较好防治效果；实验获得了控病效果表现较好的3株拮抗菌（AR01、AR02和AR03），两次重复防效实验表明三者防效均在50%以上。促生实验结果表明，3菌株均能不同程度促进烟株的生长，其中AR03促生作用昀佳。关键词：烟草青枯病，筛选，防治效果，促生作用Abstract:Controleffectandplantgrowth-promotingexperimentweretestedonSomebacteriastrains,screenedfromrhizosphericsoilsamplesfromFujianandGuizhouprovinces.TheresultindicatedthatnotallthestrainswhohadobviousinhibitionactivitiesbasedonscreeningexperimentonPetridishhadgoodcontroleffectsagainsttobaccowilt.Atthesametime,threeanti-bacterias(AR01|、AR02andAR03)wereselectedaspotentialbiocontrolagents,therecontroleffectswereover50%intworepeattests.Inplantgrowth-promotingexperiment,threestrainscouldpromoteplantgrowthinsomeextent.AndAR03wasthemosteffectivestraintopromoteplantgrowth.Keyword:Ralstoniasolanacearum,screening,controleffect,promotegrowth烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstoniasolanacearum，简称R.S）引起的一种土传病害，该菌寄主范围广，喜高温，加之缺乏抗源，易爆发流行，所以防治非常困难。对于该病害的防治，通过改进栽培措施、使用抗病品种和杀菌剂可以起到一定的效果，但都有其局限性。鉴于化学防治对环境的污染和生态平衡的破坏，因此病害的生物防治越来越被重视。在土壤中引入拮抗性微生物来防治土传病害已有70多年的研究历史了，很多报道[1，2，3]都认为生物防治在未来农业中具有重要地位。北京农业大学陈延熙教授研制的增产菌已在全国10多个省推广使用，主要用于防治水稻稻瘟病、小麦纹枯病和油菜菌核病等，田间增产率达10％-50％。魏春妹、张春明等[4]研制出番茄青枯病和烟草青枯病的生防制剂“青枯散”，田间试验证明该制剂对番茄青枯病、烟草青枯病有70％和80％的防治效果，且能增产10％，表现具有发芽势高和壮苗的作用。目前，该项目已投入产业化生产前期准备阶段。我国可利用的生防微生物资源很丰富，但现状是仅利用了其中较少的一部分，尤其是对植物病害即有拮抗作用又有促进植物生长的微生物研究与开发不足。种种实例表明，拮抗细菌种类多，繁殖速度快，广泛分布于植物根围，可与植物建立密切的关系，其中一些细菌还能促进植物生长。因此，根围拮抗细菌防治土传病害有很大潜力。我们2004、2005年在福建、贵州两省青枯病流行区采集的烟田根际土样中筛选到一批拮抗细菌[4]，本研究对其进行了温室防病促生效果的测定，结果报道如下。1材料与方法1.1材料1.1.1供试拮抗细菌菌株及来源供试细菌：AR01，AR02，AR03，AR04，1-9，1-11，分离自福建、贵州两省青枯病流行区采集的烟草根际土样。测试菌为青枯雷尔氏菌（Ralstoniasolanacearum,以下简称R.S）菌株，由广东省农科院植物保护研究所提供，经TZC培养和柯赫氏法则证明为烟草青枯病病原菌。1.1.2供试烟草心叶烟：感病品种，实验室保存。1.2根际拮抗细菌温室盆栽控病实验温室盆栽进行。实验用土为灭菌营养土。1.2.1初测将供试拮抗细菌菌株分批进行盆栽测试。每次试验设空白对照CK1（仅接清水）和发病对照CK2（仅接青枯病菌）；每处理设三次重复，每重复5-6株烟苗。具体实验过程如下：灭菌土培育烟苗至5-6叶期，将幼苗取出，于待测生防菌悬液（108cfu／ml）中浸根30min，移栽至苗钵；对照CK1浸根于清水中。1d后，将预先繁殖的青枯菌R.S配制成1×106cfu／ml的菌悬液，接种方法为灌根，接种量为5ml/株，其他按照温室常规管理。接种病原菌日为起点日，出现病株即开始调查，以后每隔5d调查一次，共调查3次。分别调查发病情况，计算病指和防效。1.2.2复测将初测实验中效果较好的4株拮抗菌株进行复测。样本量略扩大，每重复10株，共三次重复。具体实验过程如下：（1）幼苗浸根：取5-6片真叶烟苗于盆钵中拔出，浸根于预先配制好的供试生防菌菌悬液（浓度为1×108cfu/ml）中，30-40min后取出并移栽于装有灭菌土的花盆中。（2）再次灌菌：缓苗后，每隔5d于根际接种拮抗菌菌悬液，具体方法如下：用枪头在烟株根际土壤呈正方形钻穴，（深约3cm），每株共4个。将菌悬液注入穴中，1ml/穴，另取1ml淋于茎基部，充分保护烟株根际。如上述方法重复接种两次。对照接入等量清水。（3）接种发病：1d后，将繁殖的R.S配制成5×107cfu／ml的菌悬液，接种方法同上，接种部位相同，接种量共为5ml/株；CK1接等量清水。完成后，将烟株用适量清水保湿，以利发病。（4）观察记录：见病株后，每日观察记录发病株数。植株可见明显青枯病症状，即为发病株。以接种病原菌日为起点日，共观察25-30d。分级标准按全国烟草行业烟草病害调查分级标准Yc/T39-1996进行。病情指数和防治效果按烟草病害药效试验方法Yc/T40-1996计算。1.3根际拮抗细菌对烟草苗期生长的作用测定实验采用营养钵种植方式，分别于无菌土和自然土中进行。1.3.1幼苗浸根将大田壤土:农家肥:蛭石按照7:2:1比例配制基质，分别将灭菌和自然土（不灭菌）填装于育苗钵中。小心挖出5-6片真叶的烟苗，轻轻抖落附着于根部的土壤，并将其浸泡于预选配制好的R.S菌悬液（浓度约为108cfu/ml）中，30-40min后取出，分别移栽于装有灭菌土和自然土的苗钵中。每处理12株，三次重复，随机排列，温室保湿培养。1.3.2促生结果调查待烟苗长至30d后，随机选取10株烟苗，小心将苗整株挖出，洗去根部泥土，测量其株高、整株鲜重、根鲜重等指标。然后180℃烘干至恒重，测整株干重及根干重。对各处理的促生效果采用邓肯氏新复极差法进行方差分析。2结果与分析2.1温室盆栽实验整个实验过程中CK1均未发病，实验数据可用。2.1.1初测经不同批次的盆栽实验初测，获得了4株控病作用较好的生防菌株(GK12-2-2、GK12-2-1、BT8-26和X12),防治效果分别为：60.1%、54.9%、52.6%和45%，均能使处理发病率明显低于CK2组。2.1.2复测将初测结果选出4个菌株（将GK12-2-1、GK12-2-2、BT8-26和X12菌株重新编号，分别命名为AR01、AR02、AR03和AR04）进行重复测试，同时方法有所改进，目的是让拮抗菌株能够充分保护烟株根际。由于实验时间近秋季，黑夜和白昼温差大，温度较不利于发病，测试烟株发病缓慢；其中AR01、AR02和AR03仍然表现稳定良好的防病效果，分别为99.4%、99.4%和99.1%（见表.1、图.1），且能有效的推迟发病时间。另外，由于复测实验的时间的温度较初测低，发病缓慢，可能是造成两次测试的防效差别大的主要原因。表1不同菌株对烟草青枯病的防治效果Table1ControlefficacyofdifferentstrainstoRalstonia.solanacearum5d17d29d菌株Strains接种后发病时间(d)Timeofdieasedappearanceafterinoculation病指Diseaseindex防效（%）Controleffect病指Diseaseindex防效（%）Controleffect病指Diseaseindex防效（%）ControleffectAR011101000.0199.9a0.0299.4aAR021001000.0199.9a0.0299.4aAR03901000.0199.9a0.0399.1aAR047010021.628.0b22.833.3bCK1-------CK250.25-30.0-34.2-注：由于实验时间温度偏低，温差大，发病缓慢，调查时间间隔长。图1AR01、AR02和AR03对烟草青枯病的温室防效测定左为AR01处理中间为AR02处理右为AR03处理Fig.1ControlefficacyofstrainsAR01、AR02andAR03inthegreenhouse我们同时对这三株具有生防潜力的菌株于温室进行了先接种后保护的防效试验，即先接种病原菌后再接种拮抗菌，效果不理想，处理与对照发病程度相当，由此得出一定要使生防菌先占领根部有利的生态位点迅速定殖或结合抑菌作用来降低青枯病菌的群体数量，从而延缓发病时间，减轻青枯病的发病程度。另外，实验还对初测中表现负防效的菌株1-9、1-11进行重复测定，结果显示各处理仍然较对照CK2发病严重,二个处理的发病率比CK2高20%以上。2.3不同拮抗菌株对烟草苗期生长的影响促生实验结果表明，接种生防菌于灭菌土种植的烟草时，三菌株都能促进烟草生长，整株鲜重和干重增长显著，且叶色浓绿，叶片肥厚且大。经AR01处理后的烟苗其整株鲜重和干重比对照分别增长24.3%和32.6%，而根干重增长89.0%；AR02促生作用也较好，整株鲜重和干重比对照增加36.6%和52.9%，根干重增加67.1%，其中，AR03处理后的整株干重和根干重比对照分别增长121.8%和176.7%（详见表2、图2），与对照差异显著；促生作用昀佳。表2AR01、AR02和AR03菌株对灭菌土中烟草的促生作用测定结果*Table2TobaccopromotinggrowthofstrainsAR01、AR02andAR03insterilizedsoil处理平均增长率平均增长率整株增长率根干重增长率（%）Treatment株高（cm）Averagehe