第4章 植物快繁与脱毒培养

第四章植物离体无性繁殖与脱毒技术第一节植物离体无性繁殖技术第二节植物脱病毒技术有性繁殖无性繁殖无融合生殖营养繁殖繁殖方式无融合生殖：在子房和胚珠内不经受精作用而以种子进行繁殖的方式。营养繁殖：由植物体的根、茎、叶等营养器官或某种特殊组织产生新植株的生殖方式。广义上的无性繁殖。无性系：指由同一个体通过无性繁殖产生的一个群体，它们的遗传背景基本一致。目前，植物脱毒离体快繁技术仍是植物细胞工程技术应用的主流之一；是生物技术应用于生产并取得显著效益的一个领域，已广泛应用于花卉、蔬菜、果树、药材和林木的种苗生产。一、离体无繁殖的概念和意义离体无性繁殖：在离体培养条件下，将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等各种器官、组织和细胞进行无菌培养，经过不断地切割繁殖，使其再生形成完整植株，在短期内获得大量遗传性均一的个体的方法。又称快速无性繁殖或微繁殖、微体繁殖。试管苗：由离体无性繁殖获得的植株称试管苗。植物脱毒：利用植物组织培养技术，脱除植物细胞中侵染的病毒，生产健康的繁殖材料。第一节植物离体无性繁殖技术植物离体无性繁殖的意义起始材料少，生长周期短、繁殖速度“快”，每年以数万倍乃至数百万倍的速度进行繁殖，不受自然条件干扰，实现工厂化育苗；生产无病毒种苗，防止品种退化；体积微小、不携带病原菌，便于储运和种质材料交换，减少病虫害的传播；能够有效地保持优良品种的特性，使原来难以通过无性繁殖的植株进行无性繁殖。二、离体无性繁殖的类型1、腋生枝型（axillarybranching）是指利用外植体上已有的顶芽和腋芽诱导其发育成枝并培养成苗的繁殖方式。这种由芽到芽或苗的繁殖方法也被称做为“无菌短技扦插”或“微型扦插”，其繁殖速度依植物种类不同而变化范围较大，一般每个培养周期1～2月可增殖3～10倍。高等植物的每一个叶腋通常都存在着腋芽，其中每一个都能发育成为与主轴相同的枝或苗，但在自然生长情况下由于顶端优势(terminaldominance)的存在大多数腋芽受到抑制，处于休眠状态。离体条件下，在外源细胞分裂素的作用下可以使顶芽和腋芽共同发育，形成多枝多芽的小灌木丛状结构。丛生芽增殖单茎节增殖以顶芽和腋芽发育进行增殖的特点：利用外植体上已有的芽分生组织，促使其萌发形成枝条或芽，方法简单，能高度保持遗传稳定性，繁殖速度较慢。适用于绝大多数植物的繁殖，对具有特殊观赏价值的嵌合体(chimera)园艺植物来说，也是唯一能够保持其原有嵌合特性的繁殖途径。2、不定芽(adventitiousbud)型不定芽（adventitiousbud）：从顶芽和腋芽之外的任何器官和组织上通过器官发生重新形成的、无固定着生位置的芽统称为不定芽。不定芽产生的两种途径不定芽增殖的特点：直接分化途径产生的不定芽：遗传稳定、繁殖速度较快间接分化途径产生的不定芽：容易产生变异利用不定芽增殖对于繁殖园艺上的嵌合体（chimera）植物来说，容易引起嵌合体的分离。3、体细胞胚（somaticembryo）型特点：•最理想的繁殖方式，增殖系数高；•遗传相对稳定；•具有双极性结构，可以免去生根步骤；•有利于实行机械化操作。目前只有少数植物能产生胚状体，再生植株有返幼特性。4、原球茎(protocorm)型原球茎：兰花种子发芽过程中的一种形态学构造。兰科植物的种子在萌发初期并不出现胚根，只是胚逐渐膨大，以后种皮的一端破裂，膨大的胚呈小圆锥状，称作原球茎。原球茎可以萌发形成具根芽的完整小苗。离体培养中，由兰花的茎尖、侧芽、花茎、叶、根等都可作为外植体诱导产生类似于原球茎的结构即类原球茎（protocormlikebody，PLB），也称原球茎。繁殖特点：•兰科植物所特有的繁殖方式；•增殖速度快；•成苗率高。三、植物离体无性繁殖的技术invitroinvivo无菌培养物的建立（stage1）增殖培养（stage2）试管苗生根（stage3）试管苗的移植（stage4）Stage0：供体材料的准备1978年Murashige将商业性快速繁殖过程划分为四个阶段：（一）供体材料的准备：Stage0对供体植株及外植体的卫生、生理状态进行改进。可以减少外植体的污染，易于消毒，并在离体培养时启动生长较好。常采用的方法：供体植株在人工气候箱或温室栽培1-3月；喷洒抗生素；供体枝条预培养或黄化处理；修剪、嫁接、避免顶部浇水和雨后取材等。（二）无菌培养物的建立（stage1）外植体(explant)的选择依据：供体植株的基因型：遗传性状是否优良？培养难易？实用价值？外植体类型：取材难易？再生难易？遗传变异？增殖类型：诱导的难易？繁殖速度？遗传稳定性？目的：获得无菌材料，启动外植体的生长程序：外植体的选择、消毒、接种和培养外植体培养一段时间后可形成一个或多个芽，或带根的植株、胚状体、愈伤组织、原球茎等，如果将这些材料进行切割并继续培养，可以进行连续的生长繁殖的话，那么可认为已经建立了无菌培养物，可以进入离体繁殖的下一个阶段。（三）增殖培养（stage2）一种植物增殖的快慢，通常通过增殖（或繁殖）速度或增殖倍数（或系数）来表示。增殖速度（multiplicationrate）：即经一次增殖培养或在一定时间段内由一个繁殖体所增殖获得的总繁殖体数或苗数。目的：获得大量的无菌芽苗、体胚、原球茎等方法：反复进行、连续的培养繁殖（或增殖）速度的计算Y=M·XnY：年繁殖总数M：起始繁殖的无菌母株数X：每个培养周期增殖的倍数n：全年可进行增殖培养的周期次数培养物的增殖速度和植物种类、外植体类型、增殖方式、培养基成分及培养方式等有关，不同培养物之间的增殖速度差异很大。一般来说对同一种植物，增殖培养阶段的每次培养都是相同。增殖速度一般是稳定的。增殖培养是一个重复进行的培养过程。随着培养代数的增加，培养物的数量成几何数增加。050010001500200025003000350040004500123456789101112020000004000000600000080000001000000012000000140000001600000018000000123456789101112月增殖倍数为2时月增殖倍数为4时（四）试管苗生根（stage3）目的：诱导第二阶段形成的无根芽苗分化出根，最终形成具有根、茎、芽（生长点）的完整小植株，以便移栽。壮苗培养生根诱导1、壮苗培养目的：使芽苗伸长而健壮，有利于生根。壮苗阶段不需要芽苗量的增殖，而是为了获得足够数量的大苗用于生根诱导，有时也将这一处理称为芽苗的伸长阶段（elongation）。方法：降低或去除细胞分裂素，增加碳源。植物类型不同，壮苗培养时可以以单个的枝或丛状的芽苗进行。许多植物也可不需要进行单独的壮苗过程。2、试管苗生根诱导生根方式：（1）试管内生根（2）试管外生根方法：分离单个的大苗、小芽丛、枝，转入生根培养基进行培养。（1）试管内生根适用于绝大多数离体繁殖的植物生根培养基：一般选用无机盐浓度较低的培养基作为基本培养基。最常用的生长素是NAA和IBA。糖浓度要降低到1.0～1.5％。培养条件：加强光照强度。（2）试管外生根方法：（1）试管内诱导根原基后在移栽（2）生长素处理茎基部后扦插在移栽基质或营养基质中（3）直接扦插适用植物类型：一些植物生根较容易；在试管内生根时根茎部常产生大量愈伤组织而影响根与茎的联系。（五）试管苗移栽和管理（stage4）1、试管苗的特点叶的特点：叶面积较小，功能不全，易失水，合作用能力低。根的特点：无根或生根率低，根与茎输导组织不相通，根吸收功能低。茎的特点：有的植物茎的输导组织发育也不完善，木质化程度低。光合作用能力：增殖阶段，试管苗基本处于异养状态，很少或不进行光合作用；生根阶段，异养兼自养。2、移栽（transplantation）的一般方法试管苗驯化：试管苗的移栽过程实际上是试管苗逐步锻炼和适应外界环境的过程，这一过程也称驯化（acclimatization）或炼苗。目的：使试管苗适应试管内到管外的变化，能顺利成活并迅速生长。试管苗的出管移栽，要经历一系列由环境到生理功能及结构上的剧烈变化过程。环境上：无菌-有菌；高湿度--低湿度；弱光--自然条件下的强光。组织结构及生理功能上：叶片表面的角质层和蜡质层逐渐形成；气孔的适应能力、叶片的光合能力和根的主动吸收能力需要逐渐发展；异养-完全的自养。因此，试管苗的移栽中，必须尽可能的创造最适宜于试管苗生存的环境条件，使其逐步适应外界的环境条件，并正常生长。移栽的一般步骤：1）.开瓶锻炼：放在较强光照条件下或温室中，打开瓶口，锻炼1～2周左右；2）.试管苗就可以从培养瓶内取出，小心的洗去根上附着的培养基，移栽进合适的基质中；3）.精心管理，直至成活；4）.进一步培育成商品苗。1、鉴定的意义由于培养时，取材部位不同、器官发生途径不同。供体材料的遗传稳定性不同。培养基中各种物质，特别是植物激素，对植物细胞构成化学诱变环境。那些在遗传上可塑性强的种和那些易于通过不定芽再生的植物种的再生植株群体，可能会发生变异，故需要认真进行鉴定。（六）再生植株的鉴定2、鉴定方法①细胞学及分子生物学鉴定：对再生株群体抽样检查根尖染色体数目、减数分裂期的染色体行为及分子水平变异等进行鉴定。②形态鉴定：在田间对再生株的植物学性状进行鉴定，发现变异株再作细胞学鉴定。3、鉴定的内容：P67①商品性状：②健康状况：③遗传稳定性：④农艺性状：四、影响植物离体快速繁殖的因素（P67-68）1.外植体基因型供试植株和外植体本身的生理状态外植体的类型、大小、部位等2.培养基激素的使用多数仍符合“Skoog-Miller模式”最好是多个培养程序可以使用同一培养基3.培养条件温度、光照、湿度、气体状况五、离体无性繁殖过程中的技术问题（一）污染（contamination）（二）外植体的褐变(browning)（三）玻璃化(vitrification)（P69）一、病毒在植物体内的分布、传播和危害1、病毒在植物体内的分布病毒(Virus)个体微小，结构简单，成熟的个体称为病毒粒体，有球状、杆状、线条状和弹状以及分枝丝状体，直径或宽度约为10-120nm，体积比细菌小得多，能通过细菌滤器。是一种严格寄生性的专性寄生物，又称分子寄生物。第二节植物脱病毒技术病毒在植株体内的扩散：①短距离移动：通过胞间连丝在植物细胞间移动，其扩散的速度很慢。如烟草普通花叶病毒运转速度为6-13um/小时；②长距离移动：通过维管束输导组织系统移动，其扩散速度很快。如：水稻条纹叶枯病毒运转速度为25cm/小时。病毒粒子侵入植物，一旦进入韧皮部，通过维管束输导组织与营养主流一致进行双向移动，会在植物体内速度扩散。病毒在植物体内的分布早在1934年，White发现烟草花叶病毒在烟草根中的分布是不均匀的，越靠根尖（roottip）区病毒含量越低，在根尖的顶端不含病毒。病毒在植物体内呈不均匀分布，幼嫩的组织中含病毒较少，越靠近生长点的部位，病毒含量越低，生长点（约0.1～1.0mm区域）则几乎不含或含病毒很少。这也是利用茎尖培养去病毒的理论依据。传导抑制：在分生组织中，维管组织还不健全，胞间连丝也不发达，从而抑制了病毒的传导。能量竞争：分生组织的细胞不断进行活跃的分裂，需要消耗大量的能量，代谢旺盛，抑制了病毒核酸的复制。激素抑制：在分生组织中，內源激素水平较高，因而阻滞了病毒的侵入或者抑制病毒的合成。对于植物茎尖和根尖分生组织中病毒含量低的原因，主要有以下几种解释：2、病毒的传播和危害（1）病毒的传播传播（transmission)是指病毒在植物群体中的转移。病毒通过在田间寄主植株间的传播不断蔓延，造成病毒病的流行。①介体传播：病毒依附在其他生物体（昆虫、螨、线虫、真菌、菟丝子等）上，借其他生物体的活动而进行的传播。病毒在植物个体间的传播可分为两类：②非介体传播：机械传播（或汁液摩擦传播）、无性繁殖材科和嫁接传播等。植物一旦染毒，终生带毒，难用药剂控制；受侵染的植株多表现为系统发病；导致