肿瘤的基因治疗

第三章肿瘤的基因治疗GeneTherapy一基因治疗的概念◆通过分子生物学的方法将外源治疗基因导入靶细胞并有效表达，达到治疗疾病的目的。包括以下方式：•基因校正或置换———基因打靶•补赏性基因治疗•非特异性基因治疗：导入与致病基因无直接关系的基因如细胞因子基因和自杀基因等•干扰性基因治疗：如反义核酸治疗，包括反义RNA/反义DNA，抗核酸，核酶，干扰RNA等。一基因治疗的概念◆第一个基因治疗的例子——伴有酶缺陷的联合免疫缺陷症（1990，9，14，9岁女孩）•缺陷基因——腺苷酸脱氨酶（ADA）DNA和RNA合成异常导致淋巴细胞特别是T淋巴细胞受到抑制，引起免疫缺陷症。•治疗：取出T淋巴细胞——体外培养增殖———导入正常的ADA基因并有效表达———输回患者体内二基因治疗的途径◆细胞介导的体外基因治疗（exvivogenetherapy）如上例◆原位基因治疗（insitugenetherapy）直接向患病部位注射/喷雾治疗基因◆体内基因治疗（invivogenetherapy）关键是建立靶向表达载体和确定基因表达水平。ApproachestoGeneTherapyGeneTherapyforGeneticDisease1)Exvivo:removecells,culture,transfer,return2)Insitu:transfergenesintodeficienttissue3)Invivo:systemictransferofgenes体外基因的基本程序---治疗基因的选择---基因载体的选择，包括病毒载体和非病毒载体两大类---靶细胞的选择---基因转移，把治疗基因导入受体细胞的过程，是基因治疗的一根重要环节---外源基因表达的筛选---回输患者体内三基因转移方法即把外源治疗基因导入靶细胞并使其有效表达。（一）物理化学的方法--------非病毒转移•显微注射法•基因枪———微粒子轰击法•电穿孔法•脂质体法•DNA-磷酸钙共沉淀法1.Non-viralgenetherapy•NakedDNA(vector-free)•Liposomes•Protein-DNAcomplexes•Genegu•Calciumphosphateprecipitation•Electroporation•Intracellularmicroinjectio•-Humanartificialchromosomes◆Integratingviruses（整合病毒）–Retrovirus(e.g.murineleukemiavirus)（逆转录病毒）–Adeno-associatedvirus(only4kbpaccommodated)（腺相关病毒）–Lentivirus（慢病毒）◆Non-Integratingviruses（非整合病毒）–Adenovirus（腺病毒）–Alphavirus（甲病毒）–HerpesSimplexVirus（HSV,单纯疱疹病毒）–Vaccinia（痘苗病毒）B.（二）病毒载体转移技术-----常用的病毒三基因转移方法（二）病毒载体转移技术许多病毒DNA经过适当改造后，可用作载体把外源治疗基因转移到受体细胞，并使之有效表达。常用的病毒载体有：逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒等1逆转录病毒载体逆转录病毒DNA经适当改造后可作为载体优点：①转染效率高，可达到100﹪②可转导分裂活跃的细胞③外源基因可整合到染色体缺点：①不能转导非分裂细胞②导入的外源基因的长度≤8kb③有一定的危险性（激活原癌基因、插入突变）B.IntegratingversusNon-IntegratingViruses•Integratingviruses–Retrovirus(e.g.murineleukemiavirus)–Adeno-associatedvirus(only4kbpaccommodated)–Lentivirus（慢病毒）•Non-Integratingviruses–Adenovirus–Alphavirus（甲病毒）–HerpesSimplexVirus（HSV,单纯疱疹病毒）–Vaccinia（痘苗病毒）i)RetroviralvectorsAdvantages:doesn'tkillhostcellefficientlyentercellsintegrategenesstablyandheritablyDisadvantages:randomintegrationonlyaffectdividingcellsmayconverttovirulentstrainmayinduceinflammationA.Renderingvirusvectorharmless•Removeharmfulgenes“cripple”thevirus•Example–removalofenvgenevirusisnotcapableofproducingafunctionalenvelope–Envelopesarerequiredforattachmenttoandpenetrationofhostcells•Vectorsneededinverylarge#stoachievesuccessfuldeliveryofnewgenesintopatient’scells–Vectorsmustbepropagatedinlarge#sincellculture(109)withtheaidofahelpervirus•Helpervirus:normal,unmutatedretrovirusthatsuppliesnecessarycomponentsforviralreplicationof“crippled”virus•Afterreplication,helperandvectormustbeseparatedpriortotreatment三基因转移方法2。逆转录病毒载体的转移系统一般需要：①病毒载体——删除了病毒结构蛋白基因，以外源治疗基因替代，保留了包装序列ψ和两端的LTR调节序列。②辅助病毒——含有病毒结构蛋白基因，无包装序列。③包装细胞———用病毒载体和辅助病毒共转染包装细胞，病毒载体在细胞中被包装成病毒颗粒，收集假病毒颗粒（？），用其感染其他细胞可以把外源治疗基因转移到其他细胞。现在腺病毒载体已更多的应用于肿瘤的基因治疗，因为它安全，可以携带大的外源基因，可以转导分裂的或非分裂的细胞。经改进后转染效率已大大提高。Retrovirus辅助病毒病毒载体无ΨgagpolenvLTRLTRΨ治疗基因LTR病毒蛋白质治疗基因mRNA病毒颗粒转染表达包装出芽BasicPrincipleofViralGeneDelivery腺病毒Adenoviruses三．基因治疗的策略达到以下三个目的：A增加机体免疫功能，即杀伤肿瘤细胞的能力B抑制癌基因的表达，或导入正常的抑癌基因逆转肿瘤细胞的恶性表型C增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，1．向肿瘤细胞导入细胞因子或其受体基因，增加机体的局部免疫功能（非特异性基因治疗）例如：IL-2TNF-αGM-CSFHLA-B7HLA-B27等•从而增加：①促进免疫效应细胞的分化增殖即对肿瘤细胞的杀伤能力,如IL-2②直接杀伤肿瘤细胞,如TNF-α③增加肿瘤细胞的免疫源性(MHC-1,如B7等)④调节其他细胞因子的分泌肿瘤基因治疗的策略同以前介绍的各种的策略，如：#1:加强对肿瘤的免疫反应（Strengtheningoftheimmuneresponseagainstatumor）–B7在肿瘤细胞的表达位为T细胞的激活提供爹第二信号或共刺激信号（secondsignal，co-stimulation)–单克隆抗体与肿瘤细胞表面的特异抗原结合可刺激：◆NK细胞通过抗体介导的细胞毒途径杀死肿瘤细胞。◆Ear与巨噬细胞结合介导吞噬作用◆补体激活导致opsonization2．补替缺陷基因（补赏性基因治疗）•向缺失某种抑癌基因的细胞导入正常的抑癌基因，可逆转其表型，抑制其增殖，诱导其凋亡。◆例1用腺病毒载体向小鼠前列腺癌导入治疗基因P53，2天后细胞开始凋亡，3周后前列腺癌消失。◆血液中凝血因子VIII或IX缺乏——血友病A/B向骨髓干细胞导入以上凝血因子的正常基因可以治疗以上血友病。1992年，复旦大学蔡京伦教授在国内首先成功。3干扰性基因治疗------抑制癌基因的表达◆核酶和脱氧核酶——具有催化活性的RNA/DNA，设计特定的核酶，使之可以特异的识别和切割癌基因的mRNA或病毒RNA。◆抗核酸——是一些单链DNA片段，可与癌基因的某一部位特异结合形成三股DNA，从而封闭基因的表达◆反义核酸技术--------人工合成或生物合成的DNA/RNA片段，导入肿瘤细胞后，它们可以与癌基因DNA/mRNA的特定部位结合，抑制癌基因的转录或翻译。这些DNA/RNA片段称为反义核酸。AntisenseTherapyDNAoligonucleotide(oligo):•-shortstringsofnucleotides•-complementarytomRNAorDNAoftargetcellorvirusMechanism:•Oligosimpedetranscription(DNA)ortranslation(RNA)ofselectedgenesi)stability:nucleasesdegradeii)delivery:diffusion&endocytosisiii)specificity:musttargetRNAorDNAiv)toxicity:nontoxicv)price:costlyCriteriaforidealantisenseoligonucleotideApplications1.AIDS/HIV-targetgag,revandtet2.Canceri)-inhibitionofoncogeneexpressionii)-inhibitionofmulti-drugresistance(mdr1)gene3.干扰性基因治疗◆干扰RNAi（interferenceRNA,RNAi）———21～23bp的双链RNA，可以识别和结合癌基因mRNA的特定部位，促进mRNA的分解，从而抑制癌基因的表达。•例如癌基因bcl-2在Burkitt淋巴瘤中过表达,抑制细胞凋亡和增加癌细胞的抗药性，向癌细胞中导入bcl-2mRNA的反义核酸，可抑制bcl-2的表达，降低癌细胞的抗药性，和诱导细胞凋亡。也可以利用干扰RNA技术抑制bcl-2的表达4．向肿瘤细胞导入药物敏感基因（自杀基因,drugsensitivegene/suicidegene）◆自杀基因的特点：①来自细菌或病毒，人体没有。②其蛋白产物是一类核苷酸的转化酶，可以把一些无毒或低毒的核苷酸药物转化成高毒性的抗癌药物自杀基因肿瘤细胞•无毒/低毒药物————高毒性抗癌药物选择性的杀死快速分裂的肿瘤细胞•优点：①可降低用药量②降低对正常细胞的毒副作用4．向肿瘤细胞导入药物敏感基因（自杀基因,drugsensitivegene/suicidegene）例1丙氧鸟苷/胸嘧啶激酶（GCV/HSV-tk）HSV-tk（来自单纯疱疹病毒）GCV———————————GCV～3P（无毒）肿瘤细胞高毒性抗癌药物抑制DNA复制，杀死肿瘤细胞例25-氟胞嘧啶/胞嘧啶脱氨酶（5-FC/CD）CD（来自细菌/病毒）肿瘤细胞5-FC———————————5-FU无毒药物高效抗癌药物•以上两个体系已用于卵巢癌、头颈癌、结肠癌、膀胱癌等•一个很大的优点——旁观效应①高效抗癌药物的扩散②病毒颗粒向周围细胞的感染5把耐药基因导入骨髓细胞（化疗保护性基因治疗）•肿瘤化疗时，化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时强烈地抑制骨髓的造血功能，化疗前向骨髓细胞导入耐药基因可保护造血功能，有利于增加化疗药物的剂量和重复化疗。①多药耐药基因（multidrugresistancege，MD