食品卫生标准中常见致病菌的检验

沙门菌检验沙门菌概况沙门菌是1885年由Salmon氏等在猪霍乱流行时，分离出的猪霍乱沙门菌，由于Salmon氏对本属细菌的发现贡献卓越，故定名为沙门菌属。沙门菌属是肠杆菌科中最重要的病原菌。它是一群抗原结构、生化特性相似的革兰氏阴性杆菌。血清型繁多，目前已发现的沙氏菌有2500多个血清型和变种。我国自1911年至90年代初已有255个血清型。虽然沙门菌的血清型很多，但多数国家从人体、动物和食品中分离出沙门菌仅约40~50个血清型。而在一个国家中的一定时期只约有10个血清型是比较常见的。分类：伤寒沙门菌(伤寒、副伤寒)-传染病防治法中规定报告的乙类传染病。非伤寒沙门菌-食品卫生标准的检测的主要对象。沙门菌的生物学特性形态与染色性：革兰氏阴性杆菌，无芽胞,一般无荚膜。除鸡瘟沙门菌（S.pullorum)和鸡沙门菌(S.gallinarum)外均有动力。为周身鞭毛，并多数有菌毛。大小：1~3um×0.5~1um。营养需求不高，需氧或兼性厌氧。普通营养培养基上均能生长，能够利用柠檬酸盐作为碳源。在普通肠道选择性平板上基本上形成无色菌落。菌落中等大小，半透明，表面光滑，边缘整齐或呈锯齿状。不分解乳糖，大部分菌株产H2S，发酵葡萄糖产酸不产气。培养与生化特性最适培养温度为37℃，最适pH7.2～7.6。耐受胆盐，在粪便、土壤、食品、水中可生存5个月至二年之久。沙门菌的分布沙门菌广泛存在于自然环境中。通过沙门菌病患者或健康带菌的人和动物的排泄物污染环境和食品。易于污染的高危食物：畜禽肉类、蛋、奶及其制品。沙门菌在肉类中不分解蛋白质，不产生靛基质，所以当食品污染了沙门菌后，通常没有感官性状的改变。修订内容前增菌:取消样品分类，前增菌液统一为“缓冲蛋白胨水”。对所有样品均进行8~18h前增菌。原标准只对冻肉、蛋品、乳品等加工食品进行前增菌。修改了样品的处理方式：增加拍击式均质器，均质袋可直接培养。样品液增加调整pH值。选择性增菌：使用“TTB、SC”，取消“MM”。分离培养基：使用BS、XLD、HE、科玛嘉显色培养基。取消DHL、SS。生化鉴定：1.采纳API20E或VitekGNI为传统生化鉴定方法的选择性替代方法。2.生化鉴定项目进行调整：原国标中生化鉴定是将可疑菌落同时接种于三糖铁（TSI）琼脂、蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基；现修改为：在接种TSI琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时增加一项营养琼脂（NA），经TSI琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的选择后，可筛掉大部分非沙门氏菌株，大大减少了工作量，同时也满足了API20E或VitekGNI鉴定的需要。为保持与原标准的一致性，新标准也保留了可以同时直接接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、KCN培养基的内容。本部分还增加了对疑似菌落进行留样确认的部分，以备必要时复查，这对生化鉴定不确定的菌落进行进一步验证是非常必要的。血清学鉴定中的菌体分群改为选择性试验项目。报告：综合以上生化试验和血清学鉴定的结果,报告25g样品中检出或未检出沙门菌。培养基的改变旧标准前增菌：BPW增菌：MM(或TTB)、SC分离培养：BS、DHL(或HE、WS、SS)生化鉴定：生化管新标准前增菌：BPW增菌：TTB、SC分离培养：BS、XLD、显色培养基生化鉴定：生化管、API20E生化鉴定试剂盒、VITEKGNI＋生化鉴定卡沙门菌的检验程序检样前增菌法25g样品＋BPW225mL8~18h36±1℃1mL检样＋TTB10mL1mL检样＋SC10mLBSXLD(或HE、显色培养基)36±1℃40~48h36±1℃18~24h挑取可疑菌落42±1℃，18~24h36±1℃，18~24h沙门菌的检验程序可疑菌落TSI（斜面、底层、产气、H2S），蛋白胨水（靛基质），尿素（pH7.2)，KCN，赖氨酸、营养琼脂(NA)H2S＋，靛基质－尿素－，KCN－赖氨酸＋H2S＋，靛基质＋尿素－，KCN－赖氨酸＋H2S－，靛基质－尿素－，KCN－赖氨酸＋/－非如左述的各种反应结果甘露醇+，山梨醇+ONPG＋非沙门菌血清学鉴定报告商品化生化鉴定系统称取25g（mL）样品放入盛有225mLBPW的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或置于盛有225mLBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃±1℃培养8h～18h。如为冷冻产品,应在45℃以下不超过15min,或2℃～5℃不超过18h解冻。前增菌轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL,转种于10mLTTB内,于42℃±1℃培养18h～24h。同时,另取1mL,转种于10mLSC内,于36℃±1℃培养18h～24h。分别用接种环取增菌液1环,划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或显色培养基平板）。于36℃±1℃分别培养18h～24h(XLD琼脂平板、HE琼脂平板、显色培养基平板)或40h～48h(BS琼脂平板)，观察各个平板上生长的菌落。增菌与分离沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板沙门氏菌BS琼脂菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色,菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落,周围培养基不变HE琼脂蓝绿色或蓝色,多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色,中心黑色或几乎全黑色；XLD琼脂菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心科玛嘉显色培养基菌落为紫红色接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36℃±1℃培养18h～24h,必要时可延长至48h。将已挑菌落的平板储存于2℃～5℃或室温至少保留24h，以备必要时复查。生化试验自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种三糖铁（TSI）琼脂、赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板；取菌落一部分于斜面划线和底层穿刺。接种针在接种TSI后不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h。沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果三糖铁琼脂赖氨酸脱羧酶试验培养基初步判断斜面底层产气硫化氢-+＋（－）＋（－）＋可疑沙门氏菌属-+＋（－）＋（－）－可疑沙门氏菌属++＋（－）＋（－）＋可疑沙门氏菌属++＋/－＋/－－非沙门氏菌注：＋阳性，－阴性；＋（－）多数阳性,少数阴性；＋/－阳性或阴性。该表显示：只有在三糖铁斜面产酸、底层产酸；同时赖氨酸阴性的菌株可排除。其他反应结果均有沙门菌属的可能，同时也均有不是沙门菌的可能。沙门氏菌属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢（H2S）靛基质pH7.2尿素氰化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶A1＋－－－＋A2＋＋－－＋A3－－－－＋/－注：＋阳性；－阴性；＋/－阳性或阴性。反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常,按下表可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。沙门氏菌属生化反应初步鉴别表pH7.2尿素氰化钾(KCN)赖氨酸脱羧酶判定结果－－－甲型副伤寒沙门氏菌(要求血清学鉴定结果)－＋＋沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ(要求符合本群生化特性)＋－＋沙门氏菌个别变体(要求血清学鉴定结果)注：＋表示阳性；＋表示阴性。反应序号2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门菌靛基质阳性变体两项结果均为阳性；反应序号3：补做ONPG，ONPG阴性，同时赖氨酸脱羧酶阳性为沙门菌；但甲型副伤寒沙门菌赖氨酸脱羧酶为阴性。沙门氏菌属各生化群的鉴别必要时按此表进行沙门菌生化群鉴定项目ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ卫矛醇＋＋－－＋－山梨醇＋＋＋＋＋－水杨苷－－－＋－－ONPG－－＋－＋－丙二酸盐－＋＋－－－KCN－－－＋＋－注：＋表示阳性;－表示阴性。沙门菌的增菌培养基缓冲蛋白胨水(BPW)肉汤：是基础增菌培养基，不含任何抑制成分，有利于受损伤的沙门菌复苏。使受损伤的沙门菌细胞恢复到稳定的生理状态。一般用于加工食品或冷冻食品的前增菌。沙门菌的增菌液四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)：含有胆盐，抑制革兰氏阳性球菌和部分大肠埃希氏菌的生长，而伤寒与付伤寒沙门菌仍能生长。亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）：可对伤寒及其他沙门菌作选择性增菌，亚硒酸与蛋白胨中的含硫氨基酸结合，形成亚硒酸和硫的复合物，影响细菌硫代谢，从而抑制大肠埃希氏菌、肠球菌和变形杆菌的增殖。沙门菌的分离培养基亚硫酸铋琼脂（BS）：含有煌绿、亚硫酸铋能抑制大肠杆菌、变形杆菌和革兰氏阳性菌的生长，但对伤寒、副伤寒等沙门菌的生长无影响。伤寒杆菌及其他沙门菌能利用葡萄糖将亚硫酸铋还原成硫酸铋，形成黑色菌落周围绕有黑色和棕色的环，对光观察可见有金属光泽。该培养基制备过程不宜过分加热，以免降低其选择性，应在临用时配制，超过48h不宜使用。沙门菌的菌落形态：产H2S的菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色。菌落周围培养基可呈黑色或棕色，有些不产H2S的菌落，形成灰绿的菌落，周围培养基不变。注：此培养基在制作过程中过分加热可使培养基的选择性降低，与TTB或SC合用可获得更高的检出率。沙门菌的分离培养基HE琼脂：在保证细菌所需营养的基础上，加入了一些抑制剂，如：胆盐、柠檬酸盐、去氧胆酸钠等，可抑制某些肠道致病菌和革兰氏阳性菌的生长，但对革兰氏阴性的肠道致病菌则无抑制作用。沙门菌在HE琼脂上的菌落形态：蓝绿色或蓝色，多数菌株产H2S，中心呈黑色或几乎全黑色。沙门菌的分离培养基XLD琼脂：培养基中含有去氧胆酸钠作指示剂，在该浓度下的去氧胆酸钠也同时作为大肠埃希氏菌的抑制剂，而不影响沙门菌属和志贺菌属的生长。XLD培养基分离沙门菌和志贺菌的敏感性超过了传统的培养基，如：EMB、SS、BS。因这些培养基尚有抑制志贺菌属生长的潜在因素，故本培养基是分离鉴定沙门菌及志贺菌属的可靠培养基。在国外广泛使用。分离培养中的注意要点非典型的沙门氏菌菌落形态：不存在典型的或可疑的沙门氏菌菌落时，按如下步骤检验非典型的沙门氏菌菌落。HE和XLD琼脂：非典型的沙门氏菌在HE和XLD琼脂上呈黄色菌落，带或不带黑色中心。HE和XLD平板经24±2小时培养后，没有典型的沙门氏菌菌落，则挑取2个或更多个非典型的沙门氏菌菌落。BS琼脂：某些非典型菌株产生绿色菌落，其周围培养基稍微或不呈暗色。如果BS平板培养24±2小时后，没有出现典型菌落，则不挑取任何菌落，让平板继续培养24±2小时。如果经48±2小时培养后，仍没有典型或可疑的菌落出现，则挑取2个或更多个非典型的菌落。沙门菌显色培养基沙门菌显色培养基主要用于快速筛选、分离沙门菌。其基本原理：利用沙门菌特异性酶与显色基团的特有反应，使色原游离出来，沙门菌在培养基上呈紫色或紫红色。而大肠杆菌等其他肠道杆菌呈蓝绿色。色原-特定结合物色原＋特定结合物沙门菌辛酸脂酶无色显色游离可疑菌落的生化鉴定自选择性琼脂平板（至少2种选择性平板）上直接挑取2个以上可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂(TSI)。TSI的主要成分：蛋白胨、乳糖、蔗糖、葡萄糖、硫酸亚铁铵、硫代硫酸钠、酚红、琼脂。在TSI琼脂中有2个指示剂体系：--酚红:在碱性环境中呈红色；在酸性环境中呈黄色。--硫酸亚铁铵：是硫化氢的指示剂，可与硫化氢反应生成硫化铁呈黑色。硫代硫酸钠可防止硫化氢氧化形成S-S基而影响反应。沙门菌在TSI琼脂上的反应斜面底层产气H2S可能的菌属和种–++/–+沙门菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌、变形杆菌属、缓慢爱德华氏菌+++/–+沙门菌、弗劳地氏柠檬酸杆菌、普通变形杆菌–+––伤寒沙门菌、鸡沙门菌