2003年湖南省自然科学基金申请书NGU泌尿生殖道hBD-2基因表达诱导及丹参酮对其的影响

项目类别申报学科代码项目编号AC030504湖南省自然科学基金申请书(表一)项目名称：NGU泌尿生殖道hBD-2基因表达、诱导及丹参酮对其的影响申请者：所在单位：湖南中医学院邮政编码：410007通讯地址：长沙市韶山中路119号E－mail：电话：传真：申请日期：2003年5月8日湖南省自然科学基金委员会二〇〇三年制1项目类别申报学科代码项目编号AC030504湖南省自然科学基金申请书(表二)项目名称：NGU泌尿生殖道hBD-2基因表达、诱导及丹参酮对其的影响湖南省自然科学基金委员会二OO三年制2注意：湖南省自然科学基金申请书（表二）所填写全部内容不得出现申请者及项目组成员的姓名和工作单位，否则，将视为形式审查不合格。项目研究内容和意义简介（限400字）运用免疫学和分子生物学技术研究hBD-2基因在泌尿生殖道粘膜上皮的表达，hBD-2肽在非淋（支原体）感染中的作用和对支原体的杀灭活性与作用机制，以及丹参酮对hBD-2基因表达的影响。从而为非淋开创新的治疗方法提供基础，以更有效的治疗非淋球菌性尿道炎（宫颈炎）；并研究中医药对细胞基因及蛋白产物表达水平的调节作用，从较深层次探讨中医药作用机理。3一、立论依据（包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处，可加附页）对基础研究，着重结合学科发展趋势，论述项目的科学意义；对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用前景。(可加附页)人体防御素[1、2]是近年来发现的一类小分子内源性抗微生物多肽，可分为α和β防御素，不同的防御素各有其抗病原微生物的特点；而人体β防御素-2（hBD-2）发现有广谱高效抗G—、G＋菌、真菌、某些衣壳病毒、支原体的活性，且未见有耐药性。其作用机制主要是通过干扰和破坏微生物胞膜而起抑制或杀伤作用；是天然免疫的重要介质，并与获得性免疫有较密切关系[3]。防御素在泌尿生殖系统的研究成果，为治疗生殖系统的疑难病、多发病提供了全新的思路和手段。但目前学者多倾向于研究防御素在不同部位的表达及影响因素[4]。应用研究，尤其是应用天然药物诱导其表达，暂未见报导。现已证实[5]内分泌(如雌激素)和前炎症因子可调控HD-5（一种α防御素）在阴道、子宫颈、子宫、输卵管的表达；最近又发现α防御素（HNP1-3）在患有感染性盆腔疾病（PID，由淋球菌、阴道毛滴虫、沙眼衣原体引起）妇女的表达水平较无PID妇女中度升高，且强度与子宫内膜炎病情密切相关[6]。但对β防御素，特别是对可诱导表达的人体β防御素-2（hBD-2）是否亦有类似作用有待进一步实验证实。非淋菌性尿道炎（宫颈炎）为当前最为常见的性传播疾病之一，主要由衣原体和支原体引起，可致不育、不孕，给患者造成极大的痛苦。在西方国家，居性传播疾病的首位，我国2000年为253116例，占性病首位[7]。目前对非淋菌性尿道炎（宫颈炎）的治疗仍以西药抗生素（如注射用阿奇霉素[8]、克拉霉素、罗红霉素、氧氟沙星）为主，有一定疗效，但却有一定的副作用。注射用阿奇霉素可引起腹痛、恶心、呕吐、眩晕，注射部位红肿热痛等副作用；氧氟沙星有肝肾损害，对中枢神经系统及罹患孕妇胎儿的骨发育都产生不良影响；红霉素也存在胃肠道反应，使患者难以耐受。不规则治疗，反复感染和慢性迁延等因素，使得耐药菌株日益增多，交叉耐药和多种耐药明显增多[9]，有研究表明[10]支原体阳性者94.8%发生耐药，耐1种和2种药物分别占27.7%，31.6%。对红霉素耐药占86.5%。给临床治疗带来了极大困难。祖国医学认为“正气存内，邪不可干”；将抗御外邪入侵的正气称为“卫气”。《素问》：“卫者，水谷之悍气也，其气忄票疾滑利，不能入于脉内，故循皮肤之中，分肉之间，熏于肓膜，散于胸腹，逆其气则病，从其气则愈”。说明卫气是防御功能的主要成分，不仅能在体表起着屏障作用，亦可在机体内部与病邪斗争，发挥免疫作用。防御素生物学特点及分布规律与其有相似之处，值得注意的是：没有肺部感染征象的系统感染，支气管分泌物中hBD-2亦有升4高[11]，而在抗生素治疗后hBD-2有戏剧性下降，与肺主气似有一定联系[12]，为我们从中医正气入手研究防御素治疗非淋菌性尿道炎（宫颈炎）提供了可贵的思路。非淋菌性尿道炎（宫颈炎）多缠绵难愈，结合病征，临床实践，与其本“久病多虚，久病多瘀”有关。“气为血帅，血为气母”，血虚则无以载气，气亦随之而少；血瘀不去而新血不生，则又致血虚。气主固护肌表，防御外邪的入侵，气虚则外邪易于侵袭，不能鼓邪外出，病则迁延难愈。“一味丹参，功同四物”，丹参既可活血祛瘀，又可补血资气。丹参酮[13]是从中药丹参中提取的脂溶性有效成分，主要成分是隐丹参酮，具有明确的抗菌、消炎和微弱的雌性激素样活性，临床应用较广。皮肤病、妇科、心血管内科、抗肿瘤方面都取得了较好的疗效。研究证实[14]：丹参酮对TNF-α、白细胞介素、上皮细胞的分化、抑癌基因P53都可产生调节作用[15]，而TNF-α、白细胞介素[16]、雌激素[5]俱可使hBD-2表达增强。本项目组前期研究发现，hBD-2在支原体感染的人体泌尿生殖道粘膜上皮有高表达，并且支原体可以诱导大鼠rBD-2（与hBD-2有高度同源性）的表达（详细内容见研究基础）。结合防御素在泌尿生殖系统的研究现状，人体β防御素-2（hBD-2）已证实的抗微生物活性，非淋菌性尿道炎（宫颈炎）的病机特点，丹参传统功效与现代研究成果，从分子生物学角度研究人体β防御素-2(hBD-2)在非淋菌性尿道炎（宫颈炎）发病过程中的表达情况，为非淋菌性尿道炎（宫颈炎）开创新的治疗思路提供基础，以寻找更广谱有效而无耐药性的新一代抗微生物药物，以替代抗生素和解决严重的耐药性难题；研究在丹参酮参与下，人体泌尿生殖道粘膜上皮hBD-2的表达量及其mRNA水平的变化；以期通过天然药物调节机体自身正气，激发天然免疫和获得性免疫，为防御素的临床应用做出初步尝试；运用分子生物学研究中医药的“邪正学说”和卫气理论；研究中医药对细胞基因及蛋白产物表达水平的调节作用，可从较深层次探讨中医药作用机理。参考文献：1、VickiKaiserandGillDiamondExpressionofmammaliandefensingenes[J]JournalofLeukocyteBiology.2000;68:779-784.2、Schroder,J.M.Epithelialantimicrobialpeptides:innatelocalhostresponseelements[J]Cell.Mol.LifeSci.1999;56,32-463、Yang,D.,Chertov,O.,Bykovskaia,S.N.,etalB-Defensins:LinkingInnateandAdaptiveImmunityThroughDendriticandTCellCCR6[J]Science1999.(286):525-5284、ComE,BourgeonF,EvrardB,etalExpressionofantimicrobialdefensinsinthemalereproductivetractofrats,mice,andhumans.[J]BiolReprod.2003Jan;68(1):95-104.55、QuayleAJ,PorterEM,etal.Geneexpression,immunolocalization,andsecretionofhumandefensin-5inhumanfemalereproductivetract.[J]AmJPathol.1998May;152(5):1247-58.6、WiesenfeldHC,HeineRP,.Associationbetweenelevatedneutrophildefensinlevelsandendometritis[J]InfectDis.2002Sep15;186(6):792-7.7、吴志华.皮肤性病学[M].广州.广东科技出版社,2003,157-160.8、黄怀球赖维.注射用阿奇霉素治疗非淋菌性尿道炎和宫颈炎随机对照多中心临床研究[J].中国抗生素杂志.2002.27（4）：237-239.9、涂亚庭.林能兴.许长征等,解脲支原体对10种抗生素体外敏感性研究[J].岭南皮肤性病学杂志2001.3(9):137-13810、杨文林、侯捷、刘丹蓉等,523例泌尿生殖道感染者支原体培养及药敏分析[J].中国皮肤性病杂志.199812(3)：93.11、SchibliDJ,HunterHN,Thesolutionstructuresofthehumanbeta-defensinsleadtoabetterunderstandingofthepotentbactericidalactivityofHBD3againstStaphylococcusaureus[J].BiolChem.2002;277(10):8279-89.12、YHamanaka,MNakashima,AWadaetal.ExpressionofhumanBdefensin2inHelicobacterpyloriinducedgastritis:antibacterialeffectofhBD-2againstHelicobacterpylori[J]Gut.2001Oct.49:481-487.13、石乃玉.黄海金.丹参酮药理及临床应用[J].中国医师杂志.2001.3(2):150-151.14、李洪清.徐学明.丹参对慢性肾功能不全患者的白细胞介素-6和肿瘤坏死因子的影响[J].临床内科杂志.2002.19(6):470-471.15、何金涛.周清华.袁淑兰等.丹参酮对人肺癌细胞株的增殖抑制作用及其分子机理[J].中国肺癌杂志.2002.4.2(5):123-125.16、Schaller-BalsS,SchulzeA,AmIncreasedlevelsofantimicrobialpeptidesintrachealaspiratesofnewborninfantsduringinfection[J].RespirCritCareMed.2002;165(7):992-5.6二、研究方案1．研究目标、研究内容和拟解决的关键问题(可加附页)[研究目标]：a.探索hBD-2基因在泌尿生殖道粘膜上皮的表达。b．探索hBD-2肽在支原体感染中的干预作用及对支原体的杀灭活性与作用机制。c．探索临床上应用丹参酮对hBD-2基因表达的影响及hBD-2与中医卫气的关系。[研究内容]：a．正常个体，支原体感染及用丹参酮治疗后的NGU患者的泌尿生殖道粘膜中hBD-2mRNA和hBD-2肽的表达水平（定性与定量）b．支原体、IL-4、IL-13、IL-8、丹参酮对培养的泌尿生殖道粘膜上皮角质形成细胞hBD-2基因表达的影响。c．泌尿生殖道粘膜中hBD-2mRNA的RT-PCR合成扩增cDNA。d．体外hBD-2基因克隆与重组。e．重组hBD-2肽杀灭支原体的活性及作用机制。f．丹参酮对hBD-2基因表达的作用及机制。[拟解决的关键问题]：a．体外克隆的DNA的测序与鉴定。2．本项目的特色与创新之处a.国内外首次研究非淋（支原体）感染的炎症性生殖道粘膜中hBD-2基因表达水平。b.国内外首次研究支原体、IL-4、IL-13、IL-8对泌尿生殖道粘膜上皮中hBD-2基因表达的诱导。c.体外hBD-2mRNA逆转录及hBD-2cDNA的合成扩增，d.体外hBD-2基因克隆与重组。e.国内外首次研究hBD-2肽杀灭支原体的活性与作用机制。f.国内外首次研究丹参酮对泌尿生殖道粘膜上皮中hBD-2基因表达的影响及防御素与中医卫气的关系。3．拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析（可加附页）[研究方法]（1）．用免疫组化染色分析hBD-2肽在泌尿生殖道粘膜上皮中的分布。（2）．用WesternBlot技术对hBD-2肽的表达水