肌酐检测标准化 徐国超

肌酐标准化及清除率探讨新乡市中心医院检验科徐国超肾脏疾病的现状慢性肾脏病（CKD）在全球范围的发病率和患病率呈迅速增长的趋势,其主要与人们生活水平和生活方式改变相关的糖尿病、高血压发病率上升有关。2002年美国肾脏病年报，在美国早期CKD患者有1900万，其中估算肾小球滤过率eGFR60ml/min者为800万，eGFR60ml/min，尿微量白蛋白排泄率正常（30mg/gCr）有1100万。美国1988到2006年的调查同样显示，替代治疗和终末肾的发生率逐年增加。我国目前尚无大规模、权威性的调查报道，北京大学第一医院王海燕教授牵头进行的流行病学调查研究报告显示，慢性肾病的发病率占普通人群的9.4%，据此推算我国慢性肾病的患者已经超过一亿人。在临床实践中慢性肾病的早期诊断、早期检测和早期治疗就显得非常重要诊断、治疗以及监测慢性肾病的前提为正确判断肾功能。美国肾脏基金协会（NKF）将慢性肾病定义为：除外其他原因，肾脏的结构或肾功能受到损害或者肾小球滤过率下降到低于来对慢性肾病的严重程度进行分级。因此，肾小球滤过率是目前监测肾功能的最好指标。GFR测定的金标准为菊粉、碘海群（iohexol）或核素标记的DTPA清除率。这些方法复杂，操作难度大，一般仅限于研究作为建立eGFR估算方程比较对象。血清CystatinC是近几年被评价较多的反映GFR的指标，大量临床实践表明，血清CystatinC诊断GFR下降较血清肌酐的特异性和敏感度要高，与CCr相比较也稍有优势。其测定采用的是颗粒增强免疫比浊法，测定成本目前还较高。因为测定价格、适用于生化分析仪的高通量检测方法刚刚问世不久以及主要基于CystatinC估算的GFR方程发表不长时间尚需进一步验证等诸多因素，因此尚未见到有关以CystatinC为诊断指标的CKD患病率的流行病学研究的资料。血清肌酐（SCr）水平受到年龄性别、种族、肌肉量、饮食的影响，苦味酸动力学法测定方法还受黄疸、乳糜、溶血和某些药物的干扰。但由于肌酐血清水平相对恒定，不被肾小管重吸收，排泌量较少，测定廉价，是临床上应用最为广泛的评价GFR的试验。肌酐清除率（Ccr）较Scr更灵敏/特异的反映GFR下降的指标，但必须准确留取4小时、8小时或24小时尿液，病人，特别是门诊患者依从性差，也不适合于流行病调查。对于血清肌酐测定，大家已有共识：只有当GFR下降50%时才开始升高。我们以99mTc-DTPA清除率测得的肾小球滤过率（GFR）作为诊断评价的金指标，用受试者工作特征曲线（ROC）观察到肌酐最佳诊断界值为107μmol/L，与参考区间上限的99%分位值（男性110μmol/L，女性93μmol/L）接近，其诊断肾小球滤过功能受损的的灵敏度、特异性分别为74.6%、90%。如果诊断界值移到133μmol/L，灵敏度会提高，但灵敏度则下降到50%。建议以99%双侧作为血清肌酐的参考区间，但必须清楚诊断界点的诊断效能。肌酸激酶（运动）肌酸+ATP磷酸肌酸+ADP脱水自动去P肌酐90%以上由肾小球滤过而从尿中排出，仅7—10%由肾小管分泌排出，但肾小管对肌酐不重吸收。肌酐的代谢:1．代谢：肌酐是由肌肉酸脱水而生成，肌酸在肾、肝、由精氨酸、甘氨酸合成，贮于肌肉、脑中，在肌肉收缩时，可进一步代谢生成肌酐。肌酐(Cr)和内生肌酐清除率（CCr）测定正常人每天更新是恒定的，约更新2%，由肾排出，人体血液中肌酐的生成可有内、外源性两种如在严格控制饮食条件和肌肉活动相对稳定的情况下，血浆肌酐的生成量和尿的排出量较为恒定。肌酐的测定在控制外源性来源、未进行剧烈运动的条件下，肌酐的血中浓度主要取决于GFR，在肾功能受损，GFR下降到临界水平时血中肌酐浓度明显上升，随损害程度加重上升速度也加快。反映GRF减退的后期指标。当肾小球滤过功能减退至50%时，cr仍可正常。cr在临床应用中应注意动态观察和结合其他实验室指标来分析。注意事项：1.日内生理变动幅度通常在10%以内，但与个体肌肉量有关。肌肉发达者与消瘦者（尤其是肌肉萎缩者）肌酐的生理浓度可有明显差异。2.妊娠期内因生理原因GFR可上升，但肌酐生成速度不变，Scr因血浆稀释作用而比常人偏低，据调查多在35.2～52.8μmol/L水平。如孕妇Scr70.4μmol/L应视为有升高倾向。3.剧烈肌肉活动后血肌酐和尿肌酐都有一过性增加。4.进肉食对Scr和Ucr有一定影响。根据对健康人观察，摄取烹饪肉食后2-4小时内Scr可增加34-44μmol/L，可超出正常值上限，约12小时后接近正常水平。5.Jaffé（雅费氏）法主要缺点是特异性差，血中丙酮、丙酮酸、叶酸、抗坏血酸、葡萄糖、乙酰乙酸等都能在此反应中呈色，因而被称为“非肌酐色原”。此外，一些头孢类药物如甲氧噻吩头孢菌素也可与苦味酸反应显色而引起正干扰。根据Jaffé（雅费氏）反应原理发展而来的动力学方法，基于肌酐和上述非肌酐色原在反应速度上的差异，即后者与苦味酸发生反应比前者要慢，利用这一点来避开非特异反应的干扰（但不能根本消除）。此法干扰和影响因素较少，速度快，适用于自动分析，近年已被普遍采用。⑶肌酐测定。1)Jaffe反应法：测定肌酐最常用的方法是尿、血清中的肌酐与苦味酸盐作用，生成黄红色的苦味酸肌酐复合物。此法的缺点是特异性不高，维生素C、丙酮酸、丙酮、葡萄糖、乙酰醋酸、果糖、氨基马尿酸、蛋白质、胍基醋酸酰胺及许多化合物也能与碱性苦味酸盐生成红色。这些能起反应的物质称为假肌酐，相当数量的假肌酐存在于红细胞中。为去除假肌酐的影响，现在常用速率法来测定血肌酐。乙酰乙酸在20s内已与碱性苦味酸反应完成，其他多数干扰物则在80s后才与苦味酸有较快的反应，而20-80s之间主要是肌酐的反应。因此，血清与苦味酸混合后，分别读取510nm在20s及80s时的吸光度检验肌酐浓度.2）酶联法：此法特异性高，标本不需去蛋白，特别适用于自动分析。但工具酶过多、价格昂贵。三）内生肌酐清除率（CCr）1.定义：肾脏在单位时间内将若干ml血液中的内生肌酐全部清除出去。2.方法：收集24小时尿并计尿量，试验前应给受试者无肌酐饮食（禁肉类、鱼类）3天，并限蛋白入量（每日低于40g），避免剧烈运动，以排除外源性肌酐的干扰。留取24小时尿，其间保持适当的水分入量，禁服咖啡、茶等利尿性物质。准确计量全部尿量V（ml）。同时抽病人血约2-3ml。3.计算：体表面积的计算：logA(m2)＝0.425log[体重kg]＋0.725log[身高cm]－2.144参考值：根据体表面积校正后，范围为80-120ml/min/1.73m2。1999年美国肾脏病基金会（NKF）公布的K-DOQI（KidneyDiseaseOutcomeQualityInitiative）指南提出了新的CKD定义，确定CKD的诊断应基于肾小球滤过率（GFR）和/或肾损伤的证据。CKD的诊断标准为：（1）肾脏损伤（肾脏结构或功能异现常）≥3个月，可以有或无GFR下降，可表现为以下任何一条①病理学检查异常；②肾损伤的指标：包括血、尿成分异常或影像学检查异常；（2）GFR＜60ml/min/1.73m2≥3个月，有或无肾脏损伤证据。根据肾小球滤过率，K-DOQI指南将CKD分为五期I期，GFR≥90，伴有其他慢性肾损伤证据；II期，GFR60～89伴有其他慢性肾损伤证据；III期，GFR30～59；IV期，中度异常；GFR15～29；V期，已确定有肾功能衰竭；GFR15或正在接受透析。不同分期CKD患者的症状及各种合并症的发生率不同分期对于临床处治具有一定指导价值分期描述GFR(ml/方案min/1.73m慢性肾脏病危险增加≥90筛查；减少慢性肾病危险因素1肾损伤、GFR正常或增加≥90诊断并治疗合并症；减少CVD患病危险2肾损伤、GFR轻度下降60-89评估进展3GFR中度下降30-59评估治疗并发症4GFR严重下降15-29为肾脏替代治疗作准备5肾衰竭15肾脏替代治疗1999年，LeveyAS等利用了1628例CKD病人的资料，以碘酞酸盐清除率作为金标准，考虑了病人年龄、性别、血清肌酐（Scr）、尿素、白蛋白等因素，进行数学运算和方程模拟，开发了一系列GFR的评估方程，用来估算GFR，其中方程7因其结果相对准确而被广泛采用。2000年，作者又将方程7进行简化，得出主要基于血清肌酐的简化的“四变量”（年龄，性别，种族以及血清肌酐）MDRD计算方程，该计算方程仅需测量Scr，结合病人的年龄性别，即可推断出GFR。该方程中肌酐的单位为mg/dl。研究表明，MDRD方程的开发对象是CKD患者，适用于评估西方CKD人群GFR，其准确性和方便性均优于肌酐清除率（Ccr）对于糖尿病和非糖尿病患者的应用诊断效能类似。MDRD的应用应该注意：①对于健康人或GFR≥90mLmin-1的CKD患者此研究公式的性能不明。此研究公式应用于儿童，75岁以上的老年人，孕妇，有严重并发症的患者或体型极端，肌肉量大或营养不良的人可能会产生估算GFR的误差。不推荐应用于健康个体或所有住院患者肾功能的评价。②估算儿童GFR多采用Schwartz（施瓦兹）和Filler方程，因为考虑了GFR和身高/血肌酐之间的比例关系。Schwart公式：GFR=k×身高(cm)/血肌酐(μmol/L)，k为常数（0-18个月正常婴儿k为40，2-16岁女孩及2-13岁男孩k均为49，13-16岁男孩k为62）。Filler公式国际上有很多对MDRD方程的评价、改良和验证（谌贻璞.正确应用肾小球滤过功能检验十分重要.中华检验医学杂志，200730（4）：374-276），国内也作了相关的研究，对于各个方程在各期慢性肾脏病中应用研究正在进行当中。我们的研究结果发现，以简化的MDRD方程作为模型计算CKD患者eGFR，当其小于29ml/min时，SCr,CCr和CystatinC三者异常率为100%，在39-59ml/min之间时，三者为84%、91%和98%，在60-89ml/min之间时，三者则为6.8%、70%和86%。在这项普通的研究中，虽然没有进行GFR金指标的检测，但结果提示：①与其他两项具较好诊断特异性和敏感度的常规指标CCr、CystatinC比较，eGFR60ml/min时符合率很高，进一步说明60ml/min作为CKD的诊断阈值具有较好的特异性；②eGFR在39-59ml/min之间患者的SCr阳性率为84%，SCr可能有16%的假阴性，说明SCr不应该单独应用。③eGFR在60-89ml/min，甚至大于在大于90ml/min的CKD患者组中，仍有相当高比例的CCr和CystatinC异常。进一步说明，综合分析病人病史、治疗史和危险因素，联合检测SCr，eGFR，CCr和CystatinC，对于高危患者进行动态监测，将有助CKD的早期诊断血清肌酐测定方法间的偏差及其对eGFR值的影响影响eGFR估算值估计不确定度（estimateduncertainty）的来源有：①肾脏滤过功能本身的生物学变异。肾脏滤过功能受到运动、体位、血压变化、妊娠、血糖控制、细胞外液、急性或慢性肾脏病等的影响。②血肌酐的生物学变异。肾脏滤过功能本身的生物学变异等因素影响血循环或尿中各个标志物的浓度水平，包括估算方程中各个参数的浓度。有研究报告，非CKD患者血清肌酐的生物变异可以达到4.1%-4.3%。③建立模型所用“金标准的重复性和方程中各参数测定方法的准确性、重复性及其抗干扰能力（特别是肌酐测定方法的不确定度和抗干扰能力）。④回归误差考虑到各种误差的类型，指南建议eGFR偏离小于30%仍然是可以接受的。在简化MDRD方程中的诸测定参数，肌酐测定的不确定度对eGFR的影响最大。2003年美国病理学院（CAP）观察了80μmol/L没有基质效应的新鲜人血清在50个不同方法组间的测定变异，结果测定的SD为5μmol/L，以气相色谱-质谱法作为参考方法，观察常规测定结果与真值之间的差异，