05第5章核酸化学

1第5章核酸化学一、学大纲基本要求DNA、RNA的结构和性质以及研究技术。核酸的化学结构，碱基、核苷、核苷酸，DNA的结构,DNA的一级结构,DNA的二级结构,DNA结构的不均一性和多形性,环状DNA,染色体的结构。RNA的结构,RNA的类型和结构特点,tRNA的结构和功能,mRNA的结构和功能,rRNA的结构和功能。核酸的性质,解离性质,水解性质,光吸收性质,沉降特性,变性、复性及杂交。核酸研究技术,核酸的分离纯化,限制性核酸内切酶,DNA物理图谱,分子杂交,DNA序列分析,DNA的化学合成，DNA聚合酶链式反应—PCR。二、本章知识要点(一)核酸的化学组成1．元素组成核酸分子主要由碳、氢、氧、氮和磷等元素组成。与蛋白质相比较，核酸的元素组成中一般不含有硫，而磷的含量较为稳定，占核酸9％～10％。可通过测定磷含量来估计样品中核酸的含量。2．物质组成核酸在核酸酶的作用下水解为核苷酸，核苷酸完全水解可释放出等摩尔量的含N碱(碱基Base)、戊糖和磷酸。因此构成核酸的物质成分有三类：包括磷酸、戊糖和碱基。戊糖可分为核糖和脱氧核糖，碱基又分为嘌呤碱和嘧啶碱两类，DNA中的戊糖和碱基与RNA有所不同。DNA分子中的戊糖是β-D-2-脱氧核糖,RNA中的戊糖是β-D-核糖。DNA分子中存在的碱基主要有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。RNA分子中除含有A，G，C外，还含有尿嘧啶(U)，而不含有T。因此，DNA和RNA的碱基组成上，嘧啶的组成有所不同。在DNA和RNA分子中尚含有少量的不常见的其他碱基，称为稀有碱基，它们大多数是常见碱基的甲基化衍生物。3．核酸的基本单位——核苷酸组成DNA的核苷酸(nucleotide)称为脱氧核糖核苷酸，组成RNA的核苷酸称为核糖核苷酸。核苷酸则是由磷酸、戊糖、碱基组成。碱基和核糖或脱氧核糖之间脱水通过糖苷键(glycosidicbond)缩合形成核苷或脱氧核苷，戊糖的第1位碳原子与嘌呤的第9位氮原子相连构成l，9—糖苷键，而与嘧啶的第l位氮原子相连构成1，1-糖苷键。核苷中戊糖的游离羟基与磷酸之间脱水通过磷酯键缩合生成核苷酸。因核糖核苷的糖基在2＇，3＇，5＇，位上均有游离的羟基，故能分别形成2＇-3＇-或5＇-核糖核苷酸，而脱氧核糖核苷的糖基上只有3＇，5＇两个游离的羟基，所以只能形成3＇-或5＇-脱氧核糖核苷酸。生物体内游离存在的多是5＇-核苷酸。5＇-核苷酸的磷酸基上往往可以再接一分子或两分子磷酸，生成二磷酸或三磷酸核糖核苷(NDP或NTP)和二磷酸或三磷酸脱氧核糖核苷(dNDP或dNTP)。四种NTP和四种dNTP分别是合成RNA和DNA的原料。在生物体内还有一些游离的核苷酸及其衍生物，如供能物质ATP、多种激素的第二信使cAMP，cGMP等，在生物代谢过程中起重要作用。4．核苷酸的连接方式核苷酸之间靠3＇，5＇-磷酸二酯键彼此连接而组成多核苷酸链。即核苷酸戊糖的第5位碳上的磷酸基与另一个核苷酸戊糖的第3位碳上的羟基脱水缩合形成酯键。因一个磷酸基形成两个酯键，故称为磷酸二2酯键。多核苷酸链是核酸的基本结构形式，由四种核糖核苷酸(NMP)通过磷酸二酯键连接而成的多核苷酸链为RNA链。由四种脱氧核糖核苷酸(dNMP)通过磷酸二酯键连接而成的多核苷酸链为DNA链。DNA链和RNA链都具有两个游离末端，其核苷酸残基中戊糖的5位碳上带有游离的磷酸基的一端称为5′末端，戊糖的3位碳上带有游离的羟基的一端称为3′末端。多核苷酸链是以糖—磷酸构成骨架，碱基在骨架内侧。在书写核苷酸链核苷酸残基(或碱基)排列顺序时，则从5＇→3＇方向(由左至右)描述。（二）DNA的分子结构核酸的分子结构大体分为三级，DNA和RNA在分子的构象和碱基组成上有着显著的差异。1．DNA的一级结构DNA的一级结构是指多脱氧核糖核苷酸链中核苷酸残基的排列顺序，也就是核苷酸链中碱基的排列顺序。DNA对遗传信息的携带和传递是依靠核苷酸中的碱基排列顺序变化而实现的。自然界基因的长度在几十至几万个碱基之间，由于碱基的排列方式不同，因而提供的DNA编码能力几乎是无限的。2．DNA的二级结构DNA的二级结构是典型的双螺旋(doublehelix)结构。Watson-Crick双螺旋结构模型(B-DNA)的特征是：(1)反向平行双链：由两条长度相同、互为反向平行的脱氧多核苷酸链组成。碱基位于两条脱氧核糖和磷酸形成的长链骨架的内侧。(2)碱基互补配对：两条链通过碱基间形成的氢键相连，具有严格的碱基配对关系。始终是A与T配对、G与C配对。A，T之间形成二个氢键，G，C之间形成三个氢键。碱基对(bp)平面垂直于螺旋轴。(3)右手双螺旋：两条反向平行的脱氧核糖核酸链围饶同一中心轴盘饶成右手螺旋。每10个bp为一周，螺距为3.4nm，螺旋直径为2.0nm，相邻的bp平面沿轴旋转36°，上升0.34nm。双螺旋表面具有深沟和浅沟(大沟和小沟)。深沟是蛋白质识别DNA碱基序列的基础。(4)维持双螺旋结构稳定的力量：bp之间的氢键维持双螺旋结构的横向稳定，碱基平面间的疏水性堆积力维持纵向稳定。DNA的二级结构尚存在Z-DNA，A-DNA等螺旋形式。在DNA分子中碱基组成有着显著的特点：既嘌呤碱的数目与嘧啶碱的数目相等。A=T，G=C，A+G=C+T：不同种生物细胞中的DNA，碱基组成不同：同一个体不同组织器官中DNA的碱基组成相同：DNA分子的碱基组成不受年龄、营养状况的影响。3.DNA的三级结构DNA的三级结构是在二级结构基础上进一步盘饶形成的超螺旋结构。如真核细胞DNA的双链缠饶在组蛋白上构成核小体。参与核小体形成的组蛋白包括H1，H2A，H2B，H3，H4五种亚基，一个完整的核小体由核心颗粒及连接区组成。每两分子H2A，H2B，H3，H4构成八聚体与DNA形成核小体的核心颗粒，H1亚基形成核小体的连接区。DNA分子围饶核心颗粒盘饶1圈大约140bp，连接区DNA长度约为60bp，完整的核小体DNA约含200个碱基对，它是染色体的基本单位。由许多核小体形成的串珠状结构再进一步卷曲呈螺线管状排列，即为染色质纤维，染色质纤维再经几次卷曲才能形成染色单体。超螺旋结构的形成使细胞核内DNA的长度压缩了近一万倍。（三）RNA的分子结构31．RNA的类型和结构特点是指多核苷酸链中核苷酸残基的排列顺序，RNA的结构一般是以一条单链形式存在，单链折叠盘饶时存在着一些能够互补配对的核苷酸区，形成局部双螺旋结构。碱基间也有互补配对关系，A对U，G对C，A，U之间形成两个氢键，G，C之间形成三个氢键。但是，在整个RNA分子中嘌呤碱和嘧啶碱之间没有严格的相等关系。单链内不能配对的部分则被排斥在双链外，形成环状突起。这就是RNA的二级结构。细胞内含有三种主要的RNA即mRNA，rRNA，tRNA。2.mRNA的结构和功能mRNA可从DNA转录遗传信息，并作为指导蛋白质合成的模版。mRNA含量最少，仅占RNA含量的3％。但作为不同蛋白质合成模版的mRNA种类却最多。其一级结构差异很大，核苷酸数变动范围在500～6000bp之间，其分子为线形单链结构。成熟的mRNA来自于其前体核不均一RNA(hnRNA)的剪接而成。5＇-末端有一个7-甲基鸟苷三磷酸(m7-GTP)的“帽”，3＇-末端有多聚腺苷酸(Po1yA)的“尾”，该尾由30～200个腺苷酸聚合而成。其帽和尾是在转录后加上去的。中间部位为编码区，从5＇→3＇每三个相连的碱基为一组密码，称为“三联体密码子”。组成mRNA的碱基共四种，每3个组成一组密码可组成64组。其中6l组为有意义密码子，分别代表20种不同的氨基酸。3.tRNA的结构和功能tRNA的功能是在细胞蛋白质合成过程中作为各种氨基酸的载体，并将其转呈给mRNA。其分子最小，由60—90个核苷酸组成，约占RNA总量的16％。其分子组成特点是含有较多的稀有碱基和稀有核苷，包括双氢尿密啶(DHU)、假尿苷(ψ)和甲基化的嘌呤(mG，mA)。其二级结构呈三叶草型。其主要功能部位有二个，一个是3′-末端的-CCA-OH结构，起特异结合氨基酸的作用，称为“氨基酸臂”。另一个是反密码环，环上有三联的“反密码子”，它与mRNA上的密码子反向互补。于是，由tRNA携带的氨基酸可被转运到与密码子相对应的部位上。所以，tRNA尚有阅读mRNA密码子的功能。tRNA的三级结构为倒“L”型，是天然状态下的构象。4.rRNA的结构和功能rRNA是细胞内含量最多的RNA，约占RNA总量的80％。rRNA不单独存在，它与蛋白质结合为核糖体(核蛋白体)。核糖体由大、小两个亚基组成，在原核和真核生物细胞内，构成大、小亚基的rRNA的种类和数目各不相同。核糖体存在于粗面内质网和胞浆中。（四）核酸的理化性质l.一般理化性质由于DNA和RNA的多核苷酸链上即有酸性的磷酸基团，又有碱基上的碱性基团。因此，它也是两性电解质。在一定pH溶液中可带某种电荷，可用电泳方法将其分离。核酸通常显酸性，易与金属离子生成盐。可加入乙醇或异丙醇使其沉淀析出。核酸是生物大分子，具有大分子的一般特性。如易沉淀、因呈线性结构，具有一定的粘度。因核酸分子中的碱基结构中也存在着共轭双键，所以核酸具有紫外吸收特性。核酸溶液在260nm波长处具有最大光吸收，该性质可用于核酸的定量分析。2.DNA的变性、复性和分子杂交DNA的变性是指在理化因素作用下，DNA分子中的氢键断裂，碱基堆积力遭到破坏，双螺旋结构解体，4双链分开形成单链的过程。DNA变性后表现为粘度降低、紫外吸收增加(增色效应)。在实验室使DNA变性的最常用方法是加热。加热时DNA双链逐渐发生解链，紫外吸收能力逐渐增加。当紫外吸收达到最大值一半时的溶液温度称为DNA的变性温度(Tm)，亦称解链温度或熔解温度。DNATm值的大小与分子中的G—C配对含量多少及分子的长度有关。G，C含量越高Tm值越大，DNA分子越长Tm值也越大。所谓DNA的复性是指变性分开的两条单链，按照碱基互补配对原则重新形成双股螺旋的过程。通常采用降温的方法使其复性，所以DNA的复性亦称为“退火”。退火温度一般比Tm值低25℃。而分子杂交是指不同来源的核酸单链合并在一起，形成杂化双链的过程。只要这些核酸链含有可以形成碱基互补配对的序列，就可以形成部分双链。核酸分子杂交在分子生物学研究中是一项应用较多的重要实验技术。（五）核酸研究技术1.核酸的分离纯化（1）分离DNA最重要的方法有3个：一是用盐抽提，用苯酚和氯仿除去蛋白质。二是SDS存在下保温消化细胞悬液，再用苯酚和氯仿去蛋白，用RNase除去少量的RNA。三是用氯化铯密度梯度离心法分离纯化DNA。（2）制备RNA要防止RNase的降解。①器皿要高温处理或用DEPC除去RNase。②破碎细胞的同是使蛋白质变性。③RNA反应体系中加入RNase抑制剂(RNasin)。常用的RNA分离方法有两种，用酸性胍盐／苯酚／氯仿抽提。其二，用胍盐／氯化铯密度梯度离心。分离Poly(A)mRNA可用寡聚(dT)n亲和层析法。核酸的测定常用紫外分光光度法、定磷法和定糖法。测定生物样品中的核酸需要预先处理，定量提取出核酸或其成分再作测定。（3）核酸的超速离心是研究核酸的重要方法。常用的是密度梯度离心法。可用来测定核酸密度、测定G十C含量和研究核酸的构象。（4）核酸的凝胶电泳是最常用的核酸研究方法。通常用的是琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。2.限制性核酸内切酶（1）限制修饰系统，限制性内切酶往往与一种甲基化酶同时成对存在，构成一个限制修饰系统，甲基化酶使细菌自身的DNA带上标志，限制性内切酶专门用于降解入侵的外源DNA。（2）限制酶的命名：E.coRI,第一位：属名E（大写）,第二、三位：种名的头两个字母小写co,第四位：菌株R,第五位：从该细菌中分离出来的这一类酶的编号。(3)修饰一限制酶主要有三类,①类型I酶为多亚基双功能酶，对DNA甲基化和切割由同一酶完成。该酶共有二种亚基，S亚基为识别亚基，识别位点分为两部分序列，中间隔以一定长度的任意碱基对。R亚基