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蛋白质研究CAT#:111116A-20CAT#:111116B-20常温运输和保存,溶菌酶、Benzonase和PMSF需要低温运输,-20℃保存一站式GST标记蛋白质微量纯化套装one-StopGST-TaggedProteinMiniprepPack使用手册V1.0北京天恩泽基因科技有限公司北京市海淀区学院南路12号北师大留学生创业园57号楼301室QQ:944823743,449730601(销售),948393554(技术),电话:010-80638853,010-62200278(销售),15811350851(技术),order@tiandz.com原理及特点重组蛋白N端的GST谷胱甘肽S转移酶(GlutathioneSTransferase)能提高重组蛋白的水溶性,所以常用于蛋白质重组表达。GST-谷胱甘肽亲和层析是利用GST标记的蛋白能与谷胱甘肽层析介质结合,并能被还原型谷胱甘肽洗脱的特点而建立,是目前分离纯化GST标记蛋白质的重要方法。本产品就是专门用于上述目的,具有下列特点:1.一站式套装,含所需的谷胱甘肽介质、溶液和层析柱,用户只需要提供表达GST标记蛋白的细菌(酵母、杆状病毒、培养细胞)即可,非常方便。2.专一性强,一次过柱即可获得纯度高达95%的GST-标记蛋白。3.只能在非变性条件下使用,只可用于纯化没形成包涵体的GST标记蛋白。4.每次可以处理20mL的表达菌液,适合初步筛选和鉴定。5.提供2mL谷胱甘肽-Agarose介质,可吸附5-10mgGST标记蛋白质。6.本介质可以反复使用多次。规格及成分成份20次小盒包装A型(111116A-20)20次小盒包装B型(111116B-20)谷胱甘肽-Agarose介质2mL2mL10×PBS缓冲液(CAT#:100215-100)100mL100mL溶液A1mL无GST洗脱缓冲液成分一25mL25mLGST洗脱缓冲液成分二约80mg约80mg溶菌酶(20KU/mg)无30mgBenzonase(2U/uL)无20uLPMSF(10mg/mL)0.5mL0.5mL6mL层析柱(带筛板)1套1套使用手册1份1份运输及保存常温运输和保存,溶菌酶、Benzonase和PMSF需低温运输。收到货后,介质需4℃保存,溶菌酶、Benzonase和PMSF需-20℃保存,有效期一年自备试剂超纯水使用方法注意:1.每步得到的样品最好都留存少量作为SDS-PAGE分析的对照,在下面描述中就不再提醒。2.本实验需要用到的1×PBS缓冲液可用自备的超纯水稀释本试剂盒提供的10×PBS缓冲液而得。PBS缓冲液用超纯水稀释后极其容易长细菌,注意防止污染。3.GST洗脱液的配制方法是将约80mgGST洗脱液成分二全部加入到GST洗脱液成分二中,摇晃直到干粉全部溶解即得GST洗脱液,分装成小份放-20℃保存,每次用一管。一:重组蛋白的表达和细菌收集1.37℃振荡培养20mL含表达质粒的细菌到OD600=0.6-0.8。2.加IPTG到终浓度为0.1mM,30℃振荡培养3小时或22℃振荡培养8小时(或过夜)。3.4℃5000g离心10分钟收集20mL表达菌液,弃上清。4.用1×PBS缓冲液重悬细菌沉淀,4℃5000g离心10分钟,弃上清。沉淀可直接用于裂解或放-80℃保存。二:细胞裂解5.如果用本产品A型,用1mL冰浴的新鲜配制的细胞裂解液(1mL1×PBS缓冲液+50uL溶液A+25uL10mg/mL的PMSF溶液)重悬细菌沉淀,冰上超声裂解菌体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索,一般选1K-10K频率处理15次,每次20秒,间隔1分钟(必需放置在冰上)。裂解物不能粘稠,否则会堵塞层析柱。6.如果用本产品B型,用1mL冰浴的新鲜配制的细胞裂解液和25uL10mg/mL的的PMSF溶液以及1uLBenzonase,重悬细菌沉淀,重悬后再加入,冰上放置30分钟。细胞裂解液配制方法是将25mL1×PBS缓冲液和30mg溶菌酶干粉混合,溶解后分装成1mL/管,没用的部分放-20℃保存。7.将超声或酶法细胞裂解物在13000g4℃离心10分钟去除未裂解细胞和裂解细胞碎片以防堵柱,所得上清即含可溶性GST标记蛋白。三:层析柱的制备和GST蛋白纯化8.摇晃将谷胱甘肽-Agarose介质充分混匀后,取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中(介质用量需要根据GST蛋白产量决定,100mL菌液一般使用200uL介质即可)。下列步骤各溶液的用量均针对200uL介质而定,如果介质用量不同,各溶液用量需相应调整。9.用5mL预冷的1×PBS缓冲液洗柱。10.将第7步得到的上清液(含可溶性GST标记蛋白)上柱,让重力使上柱液自然流出,收集并保存穿透液用于SDS-PAGE电泳。GST和谷胱甘肽之间的结合很缓慢,所以流速一定不能快,否则结合不充分。流速一般在0.2-1mL/分钟即可。如要提高GST标记蛋白与介质的结合效率,可用本试剂盒提供的红盖将层析柱下的漏液口堵上,让细菌裂解液和介质在4℃结合30分钟或过夜。也可以将穿透液反复上柱。11.用0.5-2mL1×PBS缓冲液洗柱,收集并保存穿透液(含杂蛋白)。12.用0.2-1mLGST洗脱液洗柱,收集并保存穿透液(含GST标记蛋白)。由于可能含蛋白酶污染,所以穿透液不能在4℃放置,需立即用于后续处理(如浓度测定或SDS-PAGE电泳)或-80℃长期放置。13.对收集的2种穿透液和洗脱液进行蛋白定量或SDS-PAGE分析。注意:如果不预先脱盐,则只能用Bradford法或OD检测法(1OD280约等于0.5mg/mL蛋白)测定穿透液和洗脱液的蛋白浓度。由于GST的分子量为26KD,所以在SDS-PAGE胶上,GST标记蛋白将比天然蛋白大26KD。附:GST柱的恢复(本试剂盒不含所需试剂)1.用3倍体积的6M盐酸胍处理柱子10分钟。2.用3倍体积的超纯水处理柱子10分钟。3.用3倍体积的缓冲液一(0.5MNaCl,0.1MTrisHCl,pH8.5)处理柱子10分钟。4.用3倍体积的缓冲液二(0.5MNaCl,0.1MTrisHCl,pH4.5)处理柱子10分钟。5.再重复3-4步两次。6.用3倍体积的超纯水处理柱子3次。7.用3倍体积的1×PBS缓冲液处理柱子2次。8.堵上漏口,加3倍体积的1×PBS缓冲液待用。若长时间不用,则第7步和第8步的1×PBS改成20%的乙醇。疑难解答Q:为何GST蛋白不与柱结合或结合很弱?A:可能原因及解决办法:标签蛋白变性(使用温和裂解方法)、标签蛋白聚集(补加DTT)、标记蛋白浓度太低(浓缩样品)、标记蛋白改变了GST的构型(降低结合时的温度)、结合时间太短(延长蛋白与吸附柱的结合时间)。关联产品一站式His标记蛋白纯化试剂盒(CAT#:100102)
本文标题:111116一站式GST标记蛋白质微量纯化套装使用手册V1点0
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