07吕火祥-临床基因扩增实验室的污染来源监测及防治

临床基因扩增实验室的污染来源、监测及防治检验中心吕火烊基因扩增（PCR）实验室污染的来源•1.实验环境与实验用品•气溶胶•离心机•移液枪、滴头、离心管等•工作服、手套等•试剂•2.实验操作•试剂配制•模版提取与加样•产物分析（普通PCR）•污物处理气溶胶•定义：气溶胶（aerosol）是指悬浮于气体介质中粒径一般为0.001μm~1000μm的固体、液体微小粒子形成的胶溶状态散体系。•来源：空气与液体面摩擦。离心机离心剧烈地摇动反应管开盖吸样时及移液器的反复吸样污染物的外泄离心机1.普通离心机：用于血清或血浆分离污染原因：离心管盖松落或离心管破碎，产生气溶胶或溢出，污染同批样本，快速开盖后可污染实验环境2.生物密闭离心机：用于病原体体的分离及模版制备污染原因：离心管盖松落或离心管破碎，产生气溶胶或溢出污染离心机内腔，污染同批样本，快速开盖后可污染实验环境移液枪1.气溶胶污染反复吹打标本产生气溶胶污染内腔2.接触污染吸样过多，动作过猛带样本的移液枪平放等手套及其他1.手套：重要的污染原，可引起携带污染2.工作服：污染的工作可产生气溶胶3.滴头、离心管：被气溶胶污染基因扩增（PCR）实验室污染的来源实验操作过程中的污染1.试剂配制过程2.模板提取过程3.模板放置时,由于密封不严溢于容器外4.容器外粘有模板而造成相互间交叉污染5.模板吸取过程中,因气溶胶（aerosol）或其他原因引起移液器污染，从而导致交叉污染PCR试剂污染•PCR试剂配制过程中,移液器、容器、水等原因造成试剂被PCR核酸模板污染。基因扩增（PCR）实验室污染的来源PCR产物污染-最主要最常见•PCR产物拷贝量大，极微量的PCR产物污染,就可形成假阳性。•移液器吸取PCR产物进行电泳检测，同一支移液器去准备PCRmix•PCR产物的气溶胶污染：一个气溶胶颗粒可能含几万个拷贝基因扩增（PCR）实验室污染的来源¾实验室中克隆质粒的污染•克隆质粒浓度高,另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂,其污染可能性也很大基因扩增（PCR）实验室污染的来源PCR强大扩增能力+检测的敏感性•经30个周期后，特定DNA片段的数量在理论上可增加109倍•极微量的污染便可导致假阳性，尤其对定量造成很大的问题NTC(NoTemplateControl):必须设置一个不含模板DNA但含有PCR系统中所有其他成分的对照反应，这一对照管须在准备好所有其他PCR以后才进行吸加。基因扩增（PCR）实验室污染的监测常见的PCR污染常规PCR荧光定量PCRNTC432176598NTC防止PCR污染首要原则•永远要设置NTC对照如果不能在污染出现的第一时间发现，会导致严重的后果：一大段时间的数据不可信•准备PCR的移液器要专用千万不能用吸取PCR产物/克隆质粒的移液器去准备PCR体系防止PCR污染空间：合理分隔实验区域:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。理想状态：各个区域实验用品及移液器专用，实验前应将该区域用紫外线消毒，破坏残留的DNA或RNA。防止PCR污染操作•一旦进入吸加PCR试剂的专用场所并开始工作，就应戴上一副新手套，并应勤于更换。•准备专供自己使用的PCR试剂，分装为小份。不要与样品存放在一起。•选择质量好的Eppendorf管--密封性好且开管不需要太大力气•打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。•实验结束后及时清理台面防止PCR污染移液器操作由于操作时不慎将模板吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样时要十分小心。1）准备PCR的移液器专用2）吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，切勿形成喷雾，以免交叉污染或产生气溶胶污染。3）最好在加完所有其他反应成分后才吸加模板。4）推荐在准备PCR过程中使用滤芯枪头选用含UNG（尿嘧啶DNA糖基酶Uracil-N-Glycosylase)的试剂，有助于防止PCR产物引起的污染。UNG：50摄氏度，2分钟，作用于含有dU的DNA双链或单链然后开始PCR反应的预变性步骤，同时UNG失活防止PCR污染※对于不含dU的PCR产物无效出现污染后的处理1.确定污染源1）.阴性对照阳性、试剂空白阳性可能是试剂的问题，也可能是试剂配制室的问题。2）.阴性对照阳性、试剂空白阴性所有标本均阳性，可能是模版提取过程的问题，也可能是样本处理室的问题。2.针对可能的问题选择解决方案出现污染后解决办法•更换试剂更换新的试剂和水，用确保无污染的移液器分装备用•清洁所有可能的污染源：实验台面、小离心机、冰箱门把手等等1）实验台面、超净工作台用现配的3%双氧水或10%次氯酸钠溶液擦拭清洁。2）或者用10%漂白粉溶液擦拭3)紫外光照射，照射距离应不超过90cm，照射时间最好过夜。•实验过程中更加小心，采用前面提到的各种防止污染的办法实验室气溶胶污染的处理1.暂停所有实验操作2.清理实验室内所有物品3.加大实验室的通风4.对实验室内所有表面进行消毒5.开启紫外消毒装置6.用新开试剂、及确认无污染的器材进行原污染项目的试剂空白检测，连续3次均阴性后方可进行常规检测。发生离心事故的处理•在离心过程中发生离心管破裂，造成离心内腔污染事件的该如何处置？普通离心机•1.发现离心管破裂时，应立即切断电源，使离心机停止运行；（最好有指示牌）•2.让离心机静止30分钟•3.缓慢打开离心机盖，用消毒巾覆盖离心转子，并将离心转子浸入消毒液中，或向离心机管孔内倾注消毒液消毒30分钟•4.再用消毒纸巾覆盖离心腔表面，用消毒液喷洒消毒离心腔内部•5.然后用镊子钳取离心机管孔内及腔内的碎片•6.将消毒纸巾和离心管碎片等放入消毒液中浸泡消毒或高压灭菌•7.做好处置记录生物密闭离心机•1.立即切断电源•2.取出离心转子•3.在生物安全柜中打开离心转子或离心杯盖•4.往离心转子管孔中灌入消毒液或将离心转子放入消毒液中浸泡消毒•5.静止消毒30分钟•6.吸（倒）去消毒液，并用镊子钳取孔内破裂的离心管碎片•7.用沾有清水的纸巾擦洗离心转子管孔及表面，最后擦干•8.必要时对转子或离心杯进行高压灭菌•9.赶写处置记录样本溢出时的处理•血液或模板溢出处理1.戴手套，眼罩和一件实验外套。2.用纸巾吸取血液放在一个生物危害袋中。用镊子或其他工具收集尖锐物品并放在尖锐物存放器皿内。3.用一个洗涤剂溶液，清洗所有可见的血液溢出区域。4.用健之素（4片/升，有效氯2000mg/L）或10％家用漂白液喷雾溢出区域并空气干燥15分钟。5.15分钟接触反应后，用消毒湿巾擦净这一区域。6.将所有可处理的物品和溢出物和一些污染人员的防护装置丢弃进一个生物危害袋中。7.洗手并记录。移液枪污染的处理1.可高压灭菌移液枪：洗净后整只高压灭菌，有些可以半只灭，有些可以紫外消毒。2.不可高压的移液枪：最好更换新的移液枪。可以用消毒水浸泡枪头部分，但一定要洗干净，盐溶液干后的结晶会损伤活塞。可以用纯酒精及浸泡，但可能损伤枪内的胶垫