吉凯基因慢病毒包装系统说明书

吉凯基因慢病毒包装系统使用说明书Lenti-EasyPackagingSystemCatalogNumber:LPK001（10preps）目录目录.....................................................................................................................................31．产品组成.............................................................................................................................12．储存条件.............................................................................................................................13．您还需要准备的其他实验材料.........................................................................................14．生物安全提醒.....................................................................................................................25．慢病毒产品优势.................................................................................................................26．慢病毒系统介绍.................................................................................................................37．慢病毒包装流程介绍.........................................................................................................47.1慢病毒包装流程示意图............................................................................................47.2慢病毒载体（lentiviralvector）的制备.................................................................47.3细胞准备....................................................................................................................57.4质粒转染....................................................................................................................57.5病毒上清收集............................................................................................................67.6浓缩和纯化................................................................................................................77.7滴度测定....................................................................................................................77.7.1荧光计数法测定滴度的操作方法.................................................................87.7.2定量PCR法检测整合到基因组DNA中的病毒序列...............................107.7.3p24蛋白ELSIA试剂盒测定慢病毒滴度...................................................127.7.4qRT-PCR法..................................................................................................128．如何使用慢病毒感染目的细胞.......................................................................................138.1慢病毒感染目的细胞预实验...................................................................................138.2慢病毒感染目的细胞正式实验..............................................................................159．慢病毒的储存和运输.......................................................................................................1710．可能会遇到的问题.........................................................................................................17参考文献.................................................................................................................................18附录.........................................................................................................................................19使用说明11．产品组成Lenti-EasyPackagingMix250µl，1tube（可包装10个100mmdish）GFPControlPlasmid20µl，1tube（用于测试，可包装1个100mmdish）2．储存条件收到试剂盒后，请于-20℃保存，避免反复冻融，使用前于4℃融化，如果需要多次使用，建议在第一次融化后分装保存。3．您还需要准备的其他实验材料1）表达目的基因慢病毒载体质粒（详见7.2，第4页）2）慢病毒包装用293T细胞株3）细胞培养基及血清4）质粒转染试剂5）其他常用实验耗材（如100mm培养皿，50ml离心管等）使用说明24．生物安全提醒吉凯基因慢病毒包装系统产生的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。吉凯基因建议不要构建编码病毒基因的慢病毒载体。除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。请在生物安全II级环境下包装和使用慢病毒，操作时请穿实验服，带口罩和手套。实验结束后，用肥皂和水清洗双手。如需要离心，应使用密封性好的离心管，或者用Parafilm膜封口后离心，而且尽量使用组织或细胞培养室内的离心机。废弃的含病毒的培养基中加入84消毒液（1:20左右），浸泡1天后丢弃。接触过病毒的枪头，离心管，培养板等其他物品可用84消毒液稀释液处理，也可以用煮沸处理半小时或常规灭菌（121℃，20min）。5．慢病毒产品优势1）感染效率高：与传统的质粒转染相比，慢病毒感染细胞时无需转染试剂，且转染效率高。（参见附录：图1.质粒转染与慢病毒感染效率比较）2）感染谱更广：慢病毒可以高效的感染神经细胞、肝细胞、心肌细胞、内皮细胞、干细胞、原代细胞等多种通常不容易转染的细胞。（参见附录：图2.慢病毒可以高效感染多种细胞）3）稳定表达：相比瞬时转染，慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，并且可以稳定持续表达。（参见附录：图3.慢病毒感染后的稳定表达）使用说明36．慢病毒系统介绍慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，区别于一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。利用慢病毒载体，可以研究启动子的调控、过表达特定基因或沉默特定基因（RNAi）等。慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。为产生高滴度的病毒颗粒，需要在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。吉凯基因慢病毒包装系统由一个包装质粒混合物（Lenti-EasyPackagingMix）和一个慢病毒载体质粒（LentiviralVector）组成，包装质粒混合物中含有编码HIV病毒主要的结构蛋白的gag基因、编码病毒特异性的酶的pol基因，和编码调节gag和pol基因表达的调节因子rev基因，以及提供病毒包装所需要的单纯疱疹病毒来源的VSVG基因，慢病毒载体LentiviralVector（图3）中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE(woodchuckhepatitisvirusposttranscriptionalregulatoryelement)。通常根据不同的实验目的针对慢病毒载体（LentiviralVector）改造以进行启动子活性研究、基因表达研究、基因沉默等研究。外源基因则通过载体中的多克隆位点插入慢病毒载体（LentiviralVector）中进行表达。图1.两种常用的表达shRNA的慢病毒载体。使用说明47．慢病毒包装流程介绍7.1慢病毒包装流程示意图慢病毒载体LentiEasyPackagingMix共转染收集细胞上清液直接感染目的细胞浓缩纯化后感染目的细胞293T细胞目的细胞图2.慢病毒包装流程示意图7.2慢病毒载体（lentiviralvector）的制备在进行慢病毒包装之前，您需要先获得您感兴趣的目的基因慢病毒载体，该载体可能表达目的基因、表达shRNA或表达microRNA等。吉凯基因提供多种慢病毒载体，有多种启动子，多种筛选标记，多种表达标签或报告基因可以选择，以满足您不同的实验需求，详情请致电咨询。（参见附录：表1~表4）制备好慢病毒载体后，根据预期的病毒包装量（16µg/100mmdish，Lipofectamine2000转染法），确定需要的质粒用量并进行质粒抽提