转录后基因沉默在烟草对PVY和CMV双价抗性中的应用研究

中国农业科学院硕士学位论文转录后基因沉默在烟草对PVY和CMV双价抗性中的应用研究姓名：李路明申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：王凤龙20070601转录后基因沉默在烟草对PVY和CMV双价抗性中的应用研究作者：李路明学位授予单位：中国农业科学院相似文献(10条)1.期刊论文杨军.周汉平.宋纪真.尹启生.YANGJan.ZHOUHan-ping.SONGJi-zhen.YINQi-sheng转录后基因沉默(PTGS)与烟草抗病毒育种-中国烟草学报2006,12(6)对转录后基因沉默的特点和发生机制、PTGS与植物病毒抗性等方面进行综述,并在此基础上,就该技术策略应用于烟草抗病毒育种上的可行性进行探讨,并提出相关建议.2.学位论文周晓馥病毒载体诱导转录后基因沉默系统的建立及烟草（Nicotianabenthamiana）rbcS基因功能的研究2003RNA沉默是一种序列特异性的RNA降解过程,主要作用于同源性较高的转录产物,它广泛存在于各种生物中,在植物中称转录后基因沉默(Post-TranscriptionalGeneSilencing,PTGS)、动物中称为RNA干扰(RNAinterference,RNAi)、真菌中被称为RNA压制(RNAquelling).病毒诱导转录后基因沉默是由携带基因片段的病毒载体感染植物引起相应的寄主基因沉默的现象,是一种典型的RNA沉默现象.该论文建立了病毒载体诱导转录后基因沉默系统,并运用该体系研究烟草(Nicotianabenthamiana)的1,5二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基(Ribulose-1,5-bisphosphate(RuBP)carboxylase/oxylasesmallsubunit,rbcS)基因的部分功能.3.学位论文刘翔一种转录后基因沉默机制的研究2005转录后基因沉默是生物体中普遍存在的一种对RNA进行转录后降解的机制。近年来对转录后基因沉默现象的发现和研究为探索细胞微观调控和开辟动植物疾病治疗新途径产生了重大影响。本研究通过对野生cry1Ac基因，以及密码子优化gfp基因对转mgfp5基因烟草的诱导沉默的研究，分析了稀有密码子对转录后基因沉默的影响，探讨了稀有密码子依赖的转录后基因沉默机理—未成熟转译终止模型。通过农杆菌注射法将含有大量植物稀有密码子的野生cry1Ac基因(btw)和经过密码子优化的cry1Ac基因(btm)导入转mgfp5基因烟草。所有注射btw基因植株均出现了内源mgfp5基因的系统沉默现象，其发生沉默的速率接近注射gfp5基因的植株。注射btw基因烟草叶片中GFP蛋白含量平均下降3倍，mRNA含量也显著下降。而btm基因没有对内源mgfp5基因的表达产生影响。将btw基因CaMV35启动子更换为棉花曲叶病毒启动子，结果诱导沉默仍然发生，由此排除启动子可能的影响。将btw基因起始密码子后添加三联终止密码子，突变基因仍然诱导沉默发生，我们分析突变btw基因可能存在内部起始位点，促使转译过程仍然得以进行。上述结果表明，稀有密码子的过量使用触发了RNA沉默的发生。另一方面，由于cry1Ac基因和gfp基因序列不存在同源性(仅有10nt相同序列)，因此上述结果报道了较为严格意义的同源性非依赖的RNA沉默现象。合成全长密码子优化的gfpt基因并将该基因通过农杆菌注射法导入转mgfp5基因烟草，结果显示gfpt基因对烟草内源mgfp5基因的沉默诱导速率和频率显著低于gfp5基因。gfpt基因注射烟草中GFP含量为gfp5基因注射烟草的2.5倍，内源mgfp5基因mRNA含量也显著高于gfp5基因注射烟草。将gfpt和gfp5基因截短为5’端(234bp)、中部(225bp)以及3’端(265bp)三部分，比较其各片断对沉默诱导的差异。发现两基因经过密码子修饰的中部片断对沉默的诱导速率和程度均相近，而存在稀有密码子数量差异的5’端和3’端片断诱导沉默的速率和程度存在差异，其中以5’端片断差异最为显著。上述结果显示，通过对基因密码子的优化有效地降低了转录后基因沉默的发生，同时也证明稀有密码子在转录后基因沉默的发生过程中具有一定的作用。本研究同时对mgfpt基因和mgfp5基因在植物中的瞬时和稳定表达进行了比较。结果显示经过全长密码子优化修饰的mgfpt基因通过农杆菌注射的瞬时表达和转化烟草的稳定表达量均高于仅进行部分密码子修饰的mgfp5基因(1.8倍和1.5倍)。该修饰mgfpt基因作为植物转基因报告基因将具有一定应用价值。在研究中还发现，在发射波为507nm处进行荧光波长扫描时植物组织提取物在395nm左右的激发波处显示出显著的荧光峰值，推测该峰值即为造成植物中GFP荧光定量检测误差的原因。初步分析判断该物质不是维生素、NADH或蛋白物质。由于该未知物质形成的自发荧光峰值不受异硫氰酸胍处理的影响，由此建立了一种可以在激发波为473nm和395nm时对植物组织提取物中GFP进行精确定量的方法，并由此建立植物中gfp基因沉默程度的检测方法。4.期刊论文周晓馥.麻鹏达.王仁厚.朱筱娟.刘宝.王兴智.ZHOUXiao-Fu.MAPeng-Da.WANGRen-Hou.ZHUXiao-juan.LIUBao.WANGXing-zhi转录后基因沉默系统研究烟草rbcS基因功能-遗传学报2005,32(6)初步建立了利用病毒载体诱导转录后基因沉默系统研究烟草(Nicotianabenthamiana)1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基(Ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxylasesmallsubunit,rbcS)基因功能的模式.用携带与1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基基因同源的cDNA片段的烟草脆裂病毒载体(pTV.rbcS)侵染烟草(Nicotianabenthamiana),诱导内源rbcS基因沉默并在此基础上建立了研究rbcS基因功能的模式:初步进行了rbcS基因沉默后的表型分析、转录水平分析、蛋白质表达水平分析以及利用HPLC方法定量分析rbcS基因沉默后的光合色素变化.结果表明:病毒诱导基因沉默瞬时表达体系中烟草最佳侵染时期为苗龄21～24d,用于侵染的重组农杆菌的最佳浓度的OD值为1～1.5;烟草Rubisco小亚基的表达量可能调节Rubisco大亚基的表达量;烟草rbcS基因与光合作用中的光能收集无关.对rbcS基因沉默的烟草叶片及对照烟草叶片的部分重要光合作用指标分析表明,运用烟草脆裂病毒载体诱导转录后基因沉默系统研究烟草rbcS基因功能具有可行性,为进一步深入研究rbcS基因功能奠定了基础.5.学位论文麻鹏达基因沉默抑制子P1/HC-Pro和P25在瞬时体系中的作用2007转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)是一种序列特异性的RNA降解过程，主要作用于同源性较高的转录产物，也称为RNA沉默(RNAsilencing)。它广泛存在于各种生物中，在植物中称共抑制(cosuppression)、动物中称为RNA干扰(RNAinterference，RNAi)、真菌中被称为RNA压制(RNAquelling)。这种机制能够识别并抑制入侵的外源DNA，具有维持基因组稳定表达的重要功能，也是植物抵御病毒入侵的主要途径。与此对应，对病毒侵染过程的研究发现，一些植物病毒也能够编码特定的蛋白质来抑制植物的基因沉默反应，即通过对PTGS抑制来对抗植物病毒的防御系统。基因沉默抑制子P1/HC-Pro包括烟草蚀刻病毒基因组RNA编码蛋白P1的5’′端区域，HC-Pro蛋白以及蛋白P3的一小部分。由HC-Pro(由马铃薯Y病毒、烟草蚀刻病毒和芜菁花叶病毒编码)编码序列的单独表达也足够抑制由病毒介导的基因沉默(virus-inducedgenesilencing，VIGS)，HC-Pro作用于转录后基因沉默的持续阶段。基因沉默抑制子P25是马铃薯X病毒(potatovirusX，PVX)编码的25kDa蛋白，P25作用于基因沉默的信号阶段，这一阶段包括基因信号的产生、传递和由信号介导的基因沉默。近年来，除了HC-Pro和P25病毒沉默抑制子外，已经相继鉴定出了20多种RNA沉默的病毒抑制子。对这些抑制子的研究，将有助于加深人们对真核生物基因表达的理解，还可以丰富基因工程的研究理论。本论文选取三种植物材料：本生烟草(N.benthamiana)、转GFP的烟草(N.benthamiana(line16c))和转HC-Pro的烟草(N.benthamiana(lineab34))，建立了基于双元载体的瞬时沉默系统和病毒载体诱导转录后基因沉默系统，并研究了基因沉默抑制子P1/HC-Pro和P25在该体系的部分功能。1．成功建立了基于双元载体的瞬时沉默体系。这套沉默系统相对于病毒侵染法而言具有快速而且不受实验材料限制的特点，相对于基因枪轰击法而言具有更节约实验成本的特点。因此这套沉默可以用作其他基因沉默抑制子的鉴定和基因功能的研究。2．基因沉默抑制子P1/HC-Pro在瞬时体系中提高了GFP的表达量。因此本文为增强异源蛋白在植物体内表达的研究提供了一个新的策略，即基因沉默抑制子与目的基因的共表达，这对利用植物生物反应器表达重要经济价值的异源蛋白以便于进行商业化生产具有重要意义。3．成功制备了Rubisco大小亚基多克隆抗体，并将Rubisco小亚基多克隆抗体应用于rbcS基因沉默的检测。本论文提到的多克隆抗体的制备方法具有省时、成本低、特异性强等特点。4．建立和优化了病毒诱导转录后基因沉默系统，确定了病毒诱导基因沉默瞬时表达体系中烟草最佳侵染时期为4叶期和用于侵染的重组农杆菌的浓度为OD值为0.6-1.5。5．P25并不能影响GFP转基因位点的甲基化，说明P25虽然作用于基因沉默的信号阶段，但这些信号显然没有与引起DNA甲基化的siRNA相混，即引起系统沉默的siRNA并不在RNA介导的DNA甲基化中起作用。6．P25蛋白位于洋葱表皮细胞的细胞核和细胞质，说明P25位于洋葱表皮细胞的细胞核和细胞质是与基因沉默信号可以在细胞质核细胞质之间传递相对应，这也从侧面证明了P25作用于基因沉默的信号阶段。6.学位论文朱春晖利用转录后基因沉默（PTGS）防治作物黄瓜花叶病毒病2006本文根据已报道的CMV基因序列，设计通用引物，通过RT-PCR扩增了CMVP3613株系的RNA2片段和MP基因片段及AN株系的CP基因片段，并分别克隆到pBluescriptSK(-)载体上。根据克隆得到的序列，设计新的引物，在CP基因5′端用引物引入限制性内切酶位点Bsp120I；在RNA2片段的5′端引入限制性内切酶位点Bsp120I，3′端引入限制性内切酶位点KpnI；在MP基因的5′端引入限制性内切酶位点Bsp120I，3′端引入限制性内切酶位点PsyI。利用分子克隆的常规方法，以CP基因作为中间序列，以PGEM为中间载体，构建了两个分别具有RNA2片段和MP基因反向重复片段的原核表达载体。通过PCR、酶切、测序等方法验证，均表明构建的重组载体与预期相同。具有反向重复片段的原核表达载体通过离体转录验证，能够转录出与预期构建大小相同的片段。将具有反向重复片段的原核表达载体转化大肠杆菌菌株HT115(DE3)，经过IPTG诱导表达，破碎细胞提取到了与预期构建大小相同的片段，经过DNase和RNaseA的酶切鉴定，证实为表达的dsRNA。用能够表达dsRNA的细菌破碎后处理烟草进行攻毒的实验分为2组，每组分为相同的10个处理。接种病毒7天后采用RT-PCR方法检测。第一组先接种细菌7d后接种CMV，结果除了接种表达dsRNA的细菌的烟草抗CMV，还有另外两个处理可能因为接种方法的问题而表现无病毒。第二组先接种CMV1h后再接种细菌的结果也是接种表达dsRNA的细菌的烟草抗CMV。两组结果证明：细菌表达的dsRNA能够诱导烟草对CMV产生抗性。本论文的研究结果证实：利