第十章 中药制剂分析中新方法与新技术

第十章中药制剂分析中新方法与新技术§1现代色谱技术顶空气相色谱法（液上气相色谱法、顶空分析法）对样品基质上方的气体成分进行GC分析来测定这些组分在原样品中的含量顶空气相色谱的分类静态顶空GC动态顶空GC§1现代色谱技术顶空气相色谱法主要特点样品前处理简单检测限低可分析含量低、组成复杂的样品适用于易挥发或易分解或无法直接进样分析的液体或固体样品的分析§1现代色谱技术顶空气相色谱法应用实例静态顶空GC(内标法)测定血液中乙醇含量对照品溶液的制备将10g/l的乙醇储备液稀释10倍，精密吸取此液1ml置于10ml顶空样品瓶中，同时精密加1ml内标溶液（0.25%的正丙醇水溶液），迅速密封，即得。样品制备精密吸取1ml充分混匀的血样转移至10ml顶空样品瓶中，同时精密加1ml内标溶液（0.25%的正丙醇水溶液），迅速密封，即得。色谱条件（略）顶空分析条件平衡温度为50℃，平衡时间为10分钟（快速搅拌下），阀、输送管及定量管温度为80℃，加压为13.8kPa，加压时间、充样时间和压力平衡时间均为0.15分钟，定量管为1.0ml。§1现代色谱技术超高效液相色谱（UPLC，UltraPerformanceLiquidChromatography）主要特点固定相双（三乙氧基硅）乙烷在硅胶中形成桥式乙基基团颗粒粒度小，仅为1.7μm耐压，颗粒度分布范围很窄装柱检测器响应快样品池—10mm的光程（与普通HPLC相同）而体积只有500nL（普通HPLC的20分之一）优点更高的分析速度，更好分离效果和更高的灵敏度，速度、灵敏度及分离度，分别是HPLC的9倍、1.7倍及3倍§1现代色谱技术超临界流体色谱（SFC,supercriticalfluidchromatography）以超临界流体（低黏度、高密度以及较高的扩散系数）作为流动相。对GC及HPLC的检测器均可兼容使用适用于分析GC难以处理的高沸点、不挥发性样品分离速度较HPLC，分离效果更好。应用实例超临界流体色谱法测定怀牛膝制剂中齐墩果酸的含量§1现代色谱技术色谱联用技术多维色谱如：二维薄层色谱等气相色谱-质谱联用技术气相色谱-红外光谱联用技术液相色谱-质谱联用技术§2高效毛细管电泳(HPCE,highperformancecapillaryelectrophoresis)电泳:在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。1937年Tiselius(瑞典)利用自由溶液电泳将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白1981年Jorgenson和Luckas发展了高效毛细管电泳分离分析技术(使用75μm内径石英毛细管和采用了高达数千伏的电压)，§2高效毛细管电泳各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：ν+=ν电渗流+ν+ef阳离子运动方向与电渗流一致ν-=ν电渗流-ν-ef阴离子运动方向与电渗流相反ν0=ν电渗流中性粒子运动方向与电渗流一致可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离分离原理电场作用下，毛细管柱中出现：电泳现象和电渗流现象。§2高效毛细管电泳仪器装置电压：0～30KV。分离柱不涂敷任何固定液，紫外或激光诱导荧光检测器可检测到：10-19～10-21mol/L§2高效毛细管电泳主要特点优点高分辨率：理论塔板数高达数百万块，甚至数千万块。高灵敏度：可检测出低至10-21mol/L浓度的物质。高分析速度：可在3分钟内分离30种阴离子；1.7分钟分离19种阳离子;4分钟可分离10种蛋白质.试样用量少：仅需几nL（10-9L）的试样仪器简单，操作成本低：分析一个试样仅需几毫升流动液§2高效毛细管电泳常见的毛细管电泳模式毛细管区带电泳(CZE)毛细管胶束电动色谱(MECC)（胶束作为假固定相的电动色谱）毛细管凝胶电泳(CGE)（凝胶作为支持物，起分子筛的作用）毛细管等电聚焦电泳(CIEF)（用于蛋白质、多肽等两性物质的分离）毛细管等速电泳(CITP)§2高效毛细管电泳应用离子分析药物分析手性化合物分析氨基酸分析核酸分析及DNA测序HPCE在中药制剂分析中的应用生物碱的测定、动物类药材的鉴别、指纹图谱高效毛细管电泳法测定心舒口服液中腺苷、芦丁和阿魏酸的含量对照品溶液（略）供试品溶液的配制取心舒口服液10mL，加热浓缩至约1mL，加60%甲醇定容10mL，冰箱放置过夜，经0.45mm滤膜滤过备用。电泳条件以熔融石英毛细管(50mm×66.5cm，有效分离长度58cm)为分离通道，以105mmol/L硼砂液为运行缓冲液，压力进样50mpa，6s，毛细管柱温度为20℃，运行电压为0～30min:24kV，30～60min:28kV，检测波长为210nm，毛细管柱使用前以0.1mol/L氢氧化钠溶液、注射用水和运行缓冲液依次冲洗5,5,8min，每次电泳后以运行缓冲液冲洗8min。在此条件下，同时测定腺苷、芦丁和阿魏酸的含量。（隋印等.中国医院药学杂志.2005,25(3):232-234）§3原子吸收光谱（AAS,atomabsorptionspectrometry）工作原理1）各种元素的原子结构和外层电子排布不同，基态第一激发态:跃迁吸收能量不同——具有特征性2）各种元素的基态第一激发态最易发生，吸收最强，最灵敏线。特征谱线(共振线)。3）利用待测元素的原子蒸气中基态原子与共振线吸收之间的关系来定量分析。§3原子吸收光谱工作原理§3原子吸收光谱原子吸收光谱仪锐线光源—空心阴极灯§3原子吸收光谱原子吸收光谱仪原子化系统—将试样中离子转变成原子蒸气。原子化方法火焰法无火焰法—电热高温石墨管，激光冷原子化法单色器（色散元件（棱镜、光栅），凹凸镜、狭缝等）检测系统（光电池、光电倍增管、光敏晶体管）§3原子吸收光谱优缺点优点：原子化程度高，试样用量少（1～100μL），可测固体及粘稠试样，灵敏度高，检测限10-12g/L。缺点：精密度差，测定速度慢，操作不够简便，装置复杂。§4中药指纹图谱从整体上评价中药的内在质量中药指纹图谱建立的原则尽可能多的覆盖全貌特征明显，专属性强，重现性好方便操作与应用§4中药指纹图谱中药（化学）指纹图谱鉴别标准图谱的建立中药材的选择选用经品种鉴定的正品优质地道药材，确定图谱的特征参数。另收集多产地，具充分代表性，符合药用规格的样品，对图谱特征的重现性进行考查。随之收集一些易混淆或曾出现的伪品，以所确定的特征若能加以区别和辨认，则更为理想。实验样品的制备可根据药材所含成分选定，尽可能考虑对不同成分的兼容性，通常用不同极性的溶剂2～3种，制成供试品，供一组图谱综合鉴定应用。√注意取样代表性与均匀性。§4中药指纹图谱中药指纹图谱鉴别标准图谱的建立检测方法现代光谱（红外光谱，紫外光谱）色谱（气相色谱、薄层色谱、高效液相色谱、毛细管电泳）其它（X光衍射）§4中药指纹图谱中药指纹图谱鉴别指纹图谱的解析研究指纹图谱中特征信号的归属各指纹图谱的相关性研究直观比较相对指数、重叠率、八强峰等量化数据计算机辅助中药指纹图谱相似度计算软件§4中药指纹图谱酸醇提取液中紫外吸收成分的HPLC分析（λ=254nm）二甲亚砜提取液中可见吸收成分的HPLC分析（λ=451nm）体外培育牛黄与天然牛黄指纹图谱的比较研究(丁岗等.中国天然药物,2004,2(5)309-312）§5其他技术用生物检定法来评价中药质量例1：用生化指标评价中药质量与药效相关性更为密切，以淀粉酶活力比较测定鸡内金、鸽内金、鹌鹑内金的比活力，提出了量化数据。例2：利用大蒜提取物中大蒜辣素和大蒜新素具有抗菌作用这一特点，用生物检定方法进行检测，结果与气相色谱法测定结果一致。§5其他技术DNA分子遗传标记技术DNA分子---遗传信息的直接载体，物种鉴别更为准确可靠90年代，PCR(PolymoraseChainReaction)技术，快速而灵敏地检测DNA多态性近年来，基于PCR的RFLP、RAPD、SSR、AFLP等检测DNA多态性的分子标记技术（DNA指纹技术）。应用：在药材鉴定方面中药材地胆草与白花地胆草混淆品，西红花及其混淆品和伪品川红花、莲须、玉米须、黄花菜乌梢蛇及其混淆品、金钱白花蛇及其伪晶牛鞭、驴鞭与梅鞭