DNAPCR

现代遗传学研究方法生命科学学院遗传学教研室李杰DNA体外重组技术PCR技术植物DNA提取RNA的提取及定量检测SouthernBlot荧光定量PCR课程目录快速扩增cDNA末端，RACE酵母单杂交系统PCR-basedaccuratesynthesisoflongDNAsequences基因的体外分子进化基因原核表达毕赤酵母表达系统拟南芥实验操作蛋白质分离纯化与检测技术实验设计所需的各种DNA片段及其排列次序（设计图纸）ORF酶切位点（施工方案）实验方法和操作（施工）DNA体外重组技术酶切位点通过克隆载体引入酶切位点通过PCR引入酶切位点（需测序）部分酶切Adaptor的使用克隆的先后次序通过克隆载体引入酶切位点部分酶切Adaptor的使用通用植物表达载体pBHT-5的构建SfiASfiB克隆位点的引入衔接头设计BS1:5’-GATCCGTACGTGGCCATTA-3’BS2:3’-GCATGCACCGGT-5’SS1:5’-CGGCCGACTGGAGCT-3’SS2:3’-GGAGCCGGCTGACC-5’克隆的先后次序实验方法和操作质粒DNA的提取酶切与回收连接转化转化子的鉴定质粒DNA的提取采用碱变性小量提取法：挑取单菌落，加5ml含有相应抗生素的LB液体培养基，37℃，200r/min，振荡培养过夜。将菌液加入1.5ml离心管，4000r/min，离心5min，尽可能弃去上清。加100μL溶液Ⅰ，强烈振荡至细胞均匀分散，室温放置5min。加200μL溶液Ⅱ，颠倒混匀，动作要轻，冰浴5min。加150μL溶液Ⅲ，颠倒2~3次混匀，冰浴5min。4℃，12000r/min，离心10min，将上清移至新管，小心不要将沉淀吸入。用等体积苯酚∶氯仿抽提。4℃，12000r/min，离心5min。上清移至新管，小心不要吸入苯酚∶氯仿。加两倍体积95%的冰乙醇，颠倒混匀，4℃，12000r/min，离心10min。用70%乙醇清洗沉淀。倒掉乙醇，吹干。加入适量TE溶解电泳检测。酶切与回收双酶切体系的建立DNA的质量凝胶重量回收片段的质量连接连接体系载体和DNA片段的大小PEG的添加连接条件：温度转化子的鉴定PCR技术要点引物的设计PCR反应体系PCR反应条件PCR技术PCR技术的应用基因的分离和克隆基因改造基因检测引物设计的原则（一）①引物长度：15-30bp，常用为20mer左右引物的有效长度不能大于38mer，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性。②引物扩增跨度：以500bp为宜特定条件下可扩增长至10kb的片段。③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。引物设计的原则（二）④避免引物内部出现二级结构避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带（热启动PCR）。⑤引物3’端的碱基要求严格配对特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。⑥引物中有或能加上合适的酶切位点被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物设计的原则（三）⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。⑧引物量：每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好。引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。对于比较复杂的实验，多设计几对引物配合使用时很有效的（巢式PCR）。Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响。在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。复性温度=Tm值-（5～10℃）在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。（梯度降落PCR）复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。延伸时间：根据所用Taq酶种类和待扩增片段长度而定使用有校读功能的酶应延长延伸时间；1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min就足够了；3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些