Chapter 1 高效液相色谱法原理解析

©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL沃特世科技（上海）有限公司地址：上海市浦东新区张东路1387号41栋熊莺客户培训师TEL:15000335369Mail:[e-mail]©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIALHPLC基础液相原理©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL3目录历史色谱法原理液相色谱系统HPLC参数与术语分离度公式固定相与物理性质了解范氏方程色谱柱©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL4色谱的定义是一种分离科学在液相或气相中使化合物达到分子水平的分离Chromato--颜色Graphy--图像首先在俄国科学家Tswett(茨维特)的试验中进行了描述样品－植物提取物他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管，再加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带化合物得以分离©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL5色谱法简介色谱法（Chromatography）溯源—100多年前俄国植物学家Tswett（茨维特）分离植物色素时采用的实验方法—Tswett用希腊语chroma（色）和graphos（谱）描述他的实验方法，即现在的Chromatography（色谱法）©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL6Tswett的色谱系统©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL7色谱发展史回顾1903－1906Tswett首次使用这套色谱系统1930－1932Karrer,Kuhn和Strain用氧化钙、氧化铝和氧化铁做吸附剂1941Martin和Synge引入了柱分离色谱1944Gonsden,Gorrdon和Mardin介绍了纸分离色谱1951Kirchner引入了我们现在仍在使用的TLC1952James和Martin发展了气相色谱1964L.C.Moor发展了现在仍在使用的凝胶渗透色谱（GPC）1968高效液相色谱出现了©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL8色谱法简介色谱法的原理—是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解，分配，吸附等化学作用性能的差异，当两相作相对运动时，使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离。—两相中有一相是固定的，叫作固定相(StationaryPhase)，有一相是流动的，称为流动相(MobilePhase)，流动相又叫洗脱剂,溶剂。相（Phase）：—物理化学术语，特指在某一系统中，具有相同成分及相同物理、化学性质的均匀物质部分。各相之间有明显可分的界面。色谱法原理©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL9色谱法原理分离是一个物理过程。固定相(StationaryPhase)流动相(MobilePhase)进样(Injection)洗脱(Elution)相互作用(Interaction)©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL10按照分子量区分的色谱类型气相色谱液相色谱吸附/分离液相色谱离子交换体积排除色谱凝胶渗透/凝胶过滤©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL11HPLC的系统溶剂(流动相)泵进样器色谱柱(固定相)检测器废液数据系统©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL12什么是色谱图？色谱图（Chromatogram）：色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为时间←色谱峰时间(分)基线↓峰高峰宽©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL13术语–流动相在HPLC中流动相是液体所有要分析的样品必须能溶解在流动相中带着样品与固定相做相对运动©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL14术语–固定相色谱填料－它在色谱柱里处于固定位置执行化学分离—也被称为色谱填料或吸附剂©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL15固定相与流动相固定相与流动相具有相反的性质，正是由于这种性质的差别使他们对所分析的化合物具有竞争性©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL16液相色谱图名词术语(1)色谱图名词术语:—色谱峰(Peak):色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号—峰底(PeakBase):峰的起点与终点之间连接的直线—峰高(PeakHeight):峰最大值到峰底的距离—切线峰宽(PeakWidth):在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离—半(高)峰宽(PeakWidthatHalfHeight):通过峰高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两侧相交两点之间的距离©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL17液相色谱图名词术语(2)色谱图名词术语:—峰面积(PeakArea):峰与峰底之间的面积,又称响应值—标准偏差(σ)(StandardError):0.607倍峰高对应峰宽的一半—拖尾峰(TailingPeak):后沿较前沿平缓的不对称峰—前伸峰(LeadingPeak):前沿较后沿平缓的不对称峰—鬼峰(GhostPeak):并非由试样所产生的峰,亦称假峰©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL18液相色谱图名词术语(3)色谱图名词术语:—基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所产生的响应信号—基线飘移(BaselineDrift):基线随时间定向的缓慢变化—基线噪声(N)(BaselineNoise):由各种因素所引起的基线波动—谱带扩展(BandBroadening):由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL19色谱参数V-保留体积V0-死体积tr-保留时间k’–保留因子或容量因子-选择或分离因子N–塔板数w-峰宽R–分离度©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL20洗脱体积和峰宽这些是导出理论和定义所必需的基本测量V0=无保留化合物的洗脱体积,等于一个柱体积V1=化合物1的洗脱体积V2=化合物2的洗脱体积W2=化合物2的峰宽(以体积计)，用切线法计算©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL21容量因子（保留因子，k’）：保留能力的量度k是样品与填料作用强度的直接量度3.5.5-2k'20V0V1Vk'1:公式1.5.5-1k'19.5.5-5k'3V0V1V2V3时间.5125描述了峰距离V0有多远与流速、时间和柱子尺寸无关©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL22容量因子k’k’与组分在流动相和固定相之间的平衡有关k’是一个平衡常数©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL23在正相与反相色谱中的容量因子k’容量因子的大小取决于流动相和固定相的极性可以通过改变流动相中有机相的比例来改变流动相的极性只适用于吸附和分配色谱©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL24通过改变流动相的极性改变k’©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL25分离因子（选择因子，）：峰分离程度的量度0V1V0V2V1k'2k'或3.5-1.5-212/的峰峰9.5-1.5-513/的峰峰V0V1V2V3时间.51251,21,3相邻两个峰k’值的比值描述的两个峰的相对位置取决于系统的“化学”属性α是两个化合物在同一套色谱系统上保留差异的数值表述©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL26分离因子（）的影响因素－流动相取决于流动相的“化学”性质，即选择不同的有机相©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL27分离因子（）－固定相©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL28分离度（R）的定义式简单说来,分离度即是两峰相对于其峰宽分开得有多远©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL29R:分离程度的量度此处是几个计算分离度的实例2112WW21ttR8.5.5211-5tR1-32.5.5211-2tR1-2t0t1t2t3时间.5125©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL30理论塔板数（N）：柱效的量度理论塔板数计算公式：Wσ方法Wtan16切线法Wh5.54半峰高W3σ93σW4σ164σW5σ255σ21WVN©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL31理论塔板数（N）:分离效率的量度理论塔板数或柱效是一个数值,它表示作为保留时间函数的峰展宽的量度1600N.5516NWV16N22100N2516NWV16N22PW=.5PW=2©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL32柱效的计算－5σ方法©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL34分离度方程式1N141R分离因子柱效容量因子分离度方程式描述了分离度与选择性,柱效和容量因子之间的关系它是评价一张色谱图以及决定如何解决、开发和优化分离方法的依据©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL35分离度方程式如果N增加2倍或3倍，R会怎样？1141RN©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL36N对分离度（R）的影响©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL37分离度方程式如果k=1,2，10，20分离度分别是多少？1N141R©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL38k’对分离度的影响©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL39分离度方程式如果＝1或1.4分离度分别是多少？1N41R1©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL40对分离度的影响©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL41，k’，N:如何控制分离度?原始分离情况改变k’改变改变N©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIA