实验十、植物细胞骨架光学显微观察

十、植物细胞骨架光学显微观察内蒙古大学生技基地一、实验目的观察光学显微镜下细胞骨架的结构，了解显示植物细胞骨架的方法及其原理。二、实验原理细胞骨架是指在细胞中支持和连接细胞各组分，以及与细胞运动有关的结构，它包括微管、中间纤维、微丝。当用适当浓度的TritonX-100处理时，可将细胞内大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白质却仍被保存，经过固定和考马斯亮蓝R250染色，从而在光镜下观察到细胞骨架的网状结构。(一)器材：显微镜、50ml烧杯、滴管、容量瓶、载玻片、盖玻片、镊子。(二)试剂：1．M一缓冲液作用：M缓冲液使细胞骨架中的微丝保持稳定。在M缓冲液中，其中咪唑是缓冲剂EGTA和EDTA螯合Ca离子，溶液并提供Mg离子，在低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张，便于观察。配方：50mmol／L咪唑，50mmol／LkCl：，0.5mmol／LMgCl2，lmmol／LEGTA(乙二醇双(a-氨基乙酸)醚四乙酸)，0．1mmoL／LEDTA，lmmol／L巯基乙醇或DTT(二硫苏糖醇)。三、实验用品2．6mmol／LPH6．8磷酸缓冲液。3．1％TritonX-100，用M-缓冲液配。4．0.2％考马斯亮蓝R250，其溶液是甲醇46.5ml，冰乙酸7ml，蒸馏水46.5ml。5．3％戊二醛，用6mmol／L磷酸缓冲液(PH6．8)配制。6．5％、7％、95％乙醇。7．叔丁醇、正丁醇、二甲苯、树胶。(三)材料：洋葱鳞茎。磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液优缺点：•磷酸缓冲液的优点：（1）易配制各种浓度的缓冲液；（2）适用的pH值范围宽，可配置各种pH值的缓冲液；（3）pH受温度影响较小；（4）缓冲能力强，缓冲液被稀释后pH变化小。•磷酸缓冲液的缺点：（1）易与常见的钙离子Ca2+、Mg2+及一些重金属离子缔合形成沉淀；（2）会抑制某些生化反应过程，如抑制某些酶的催化过程等。考马斯亮蓝R-250考马斯亮蓝R-250是通过范德瓦尔键与蛋白质结合，尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。它与不同蛋白质结合呈现出基本相同的颜色，并且在比较宽的范围内（15—20g），扫描峰的面积与蛋白量呈线性关系。用考马斯亮蓝R-250后电泳图考马斯亮蓝R-250（固体）(一)取洋葱鳞茎内表皮细胞(约lcm2大小)若干片温于装有PH6．8磷酸缓冲液的50ml烧杯中，使其下沉。(二)吸去磷酸缓冲液，用1％TritonX-100处理20-30分钟。(三)吸去TritonX-100，用M-缓冲液洗3次，，每次10分钟。．(四)3％戊二醛固定0.5-1小时(对照组开始处理)。(五)PH6.8磷酸缓冲液洗3次，每次10分钟。四、实验方法(六)用0.2％考马斯亮蓝R250染色20-30分钟。(七)用蒸馏水洗1-2次，材料置于载玻片上，加盖玻片，即可镜检。(八)如作永久制片，可使样品顺序通过如下试剂：50％乙醇，70％乙醇，95％乙醇，95％乙醇和叔丁醇混合液(1：1)，每次5-10分钟，或正丁醇→正丁醇→二甲苯→二甲苯，每次5-10分钟。然后捞取样品，平展于载玻片上，中性树胶封固。光学显微镜下洋葱内表皮细胞的轮廓清晰可见（如图1），细胞壁及其分界明显。10×10倍镜下可粗略观察到细胞内粗细不等的蓝色纤维、团块形成的网状结构。同一细胞内各处骨架的密集度不均匀，细胞核区域的纤维相对密集，蓝色浓重，甚至分辨不出网络结构，另外可见细胞壁区域有零星蓝色纤维分布；相邻细胞的密集程度基本一致，细胞骨架观察结果：a：10×10倍光镜下洋葱鳞茎内表皮细胞骨架（箭头示细胞核区域重染色区）b：10×40倍光镜下洋葱鳞茎内表皮细胞骨架（上方箭头示膜骨架，下方箭头示胞间连丝处骨架纤维）c：10×100倍光镜下病变细胞骨架与正常细胞的对比（注意两箭头处染色对比）细胞边缘骨架较稀疏，但有少数细胞有较大不同。10×40倍镜下可清楚观察到蓝色的网状结构确实由线性纤维交织成，纤维间的结合点稍膨大。细胞边缘骨架较稀疏，但可见由与胞壁相同走向的纤维形成的细胞质膜的轮廓，与细胞内部的纤维通过纵向的纤维相连。相邻细胞有纤维穿过胞间的细胞壁。调节显微镜焦距可观察到细胞不同横切面的网络结构的变化，表明细胞骨架以三维立体结构的形式分布在整个细胞内。病变细胞的骨架细胞骨架对细胞的生存有重要作用，故细胞骨架可在一定程度上反映细胞的生理状态。制片中可见个别细胞纤维网络与附近细胞相比非常稀疏（图1c），由于细胞骨架必须形成一定密度的网络系统才能维持细胞的正常功能，可推测这些细胞发生病变或已经死亡。这些细胞有一个特征，即胞质边缘的蓝色较浓重，但不呈纤维状，可以猜测由于病变，骨架纤维断裂，断裂片段转移到其他细胞进行再利用。五、作业1．比较对照组和处理组的细胞骨架结构有何不同？2．绘制细胞骨架图。thanks