DNA的粗提取与鉴定课件

实验材料的选取材料：鱼卵、猪肝、菜花（花椰菜）、香蕉、鸡血、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是，选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大•鸡是真核生物，真核生物的DNA都在染色体上。•鸟类的血细胞核大，DNA多•不需要破除细胞壁•问题：鸡血细胞液在取材之后，到实验前，是否需要特殊处理吗？•柠檬酸钠抗凝一、实验原理①、DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，在0.14mol/L的NaCl溶液中的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出。②、DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出杂质较少的DNA。③、DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色。因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。二、目的要求初步掌握DNA粗提取和鉴定方法，观察提取出来的DNA物质。三、材料：鸡血细胞液（5-10ml），体积分数为95%的酒精溶液（冷却），蒸馏水，质量浓度为0.1g/ml的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为2mol/l和0.015mol/l的氯化钠溶液，二苯胺试剂取质量浓度为0.1g/ml的柠檬酸钠溶液（抗凝剂）100ml，置于烧杯中，将新鲜鸡血180ml注入，同时用玻璃棒搅拌，以免凝血，然后倒入离心管中用1000r/min的离心机离心2min，此时，血细胞沉淀于离心管的底部，除去上清液，就可以得到鸡血细胞液。问：提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液中的上清液？四、方法步骤：1、制备鸡血细胞液鸡血细胞液答：上清液是血清，不含有血细胞，而DNA存在于鸡血细胞中，所以要把上清液除去。沉淀加入浓度为0.1g/ml的柠檬酸钠溶液（抗凝剂）：防止鸡血细胞液凝固。新鲜鸡血2、提取鸡血细胞的细胞核物质将制备好的鸡血细胞液5-10ml，注入烧杯中，加入蒸馏水20ml，同时用玻璃棒沿一个方向快速搅拌，使血细胞的细胞膜和核膜加速破裂，过滤，取其滤液。过滤鸡血细胞液加入蒸馏水20ml。目的是：使细胞吸水涨破，释放出细胞中的DNA。获得含核物质滤液将物质的量浓度为2mol/l的氯化钠溶液40ml加入到滤液中，搅拌使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态。3、溶解细胞核内的DNADNA溶解液取含核物质滤液加入浓度为2mol/L的氯化钠溶液40ml沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时轻轻搅拌，这时会有丝状物出现，随着蒸馏水的加入逐渐增多，一直到氯化钠浓度约为0.14mol/l时，不再继续增加。过滤5、滤取含DNA的黏稠物4、析出含DNA的黏稠物加入蒸馏水。目的是：降低NaCI的浓度，析出DNA。获得DNA的黏稠物(白色乳状)在烧杯中注入物质的量浓度为2mol/l的氯化钠溶液20ml，使黏稠物尽量多溶解于溶液中。6、将DNA的黏稠物再溶解用纱布过滤，取其滤液，DNA溶于滤液中7、过滤含有DNA的氯化钠加入浓度为2mol/l的氯化钠溶液20ml过滤获得含DNA的滤液在溶液中加入冷却的酒精溶液50ml，溶液中出现杂质较少的丝状物（它的主要成分就是DNA）。8、进一步提取含杂质较少的DNA加入冷却的酒精溶液50ml含DNA的滤液析出含DNA杂质较少的丝状物9、DNA的鉴定取两支20mL的试管，各加入浓度为0.015mol／L的氯化钠溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。加入0.015氯化钠溶液5mL不加入丝状物加入4mL的二苯胺试剂DNA+二苯胺蓝色加入0.015氯化钠溶液5mL加入丝状物加入4mL的二苯胺试剂例：下图为“DNA的粗提取与鉴定”的实验装置，请回答问题。(1)实验材料选用鸡血细胞液，而不用鸡全血，主要原因是鸡血细胞液中含量较高。(2)在图A所示的实验步骤中加蒸馏水20mL的目的是，通过图B所示的步骤取得滤液，再在滤液中加入2mol/L的NaCl溶液的目的是；图C所示实验步骤中加蒸馏水的目的是。(3)为鉴定实验所得丝状物的主要成分是DNA，可按图D所示进行实验，滴加溶液。(4)a试管为对照组，b试管为实验组。①a试管现象；b试管现象。②在沸水中加热的目的是，同时说明DNA对高温有较强的。③a试管在实验中的作用是。④b试管中溶液颜色的变化程度主要与有关。加快颜色反应速度DNA使血细胞吸水涨破，放出DNA使滤液中的DNA溶于浓盐溶液使DNA析出二苯胺溶液不变蓝溶液变蓝耐受性对照加入丝状物的多少步骤：②提取血细胞核物质(蒸馏水涨破)④溶解(2mol/L的NaCl)③过滤(含核物质滤液)⑤析出(滴蒸馏水，降NaCl浓度至0.14mol/L)⑥过滤（DNA的黏稠物）⑦再溶解(2mol/L的NaCl)⑧过滤（含DNA的滤液）⑨进一步提纯(体积分数为95%的冷却酒精)⑩鉴定①制备鸡血细胞液•方案二：直接在滤液中加入嫩肉粉，反应10-15min•嫩肉粉的主要成分是木瓜蛋白酶•蛋白酶能分解杂质蛋白，但对DNA没有影响，从而使提取的DNA与蛋白质分开•方案三：将滤液放在60-75℃的恒温水浴箱中保温10-15min。•大多数蛋白质不能忍受60-80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性•利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。