第八章 酶定向进化

第八章酶定向进化•天然酶的应用及局限性酶的定向进化的思想酶的定向进化的策略和方法酶的定向进化技术的展望•生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中,并维持其独立性和生命的延续性,都是因为生物体内的一系列酶在发挥着作用.酶保证了生物体内组成生命活动的大量生化反应得以按照预定的方向有序,精确而顺利地进行,几乎所有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关,可以这样说,没有酶的存在,就没有生物体的一切生命活动.天然酶的应用•利用酶作为催化剂进行生物催化与生物转化,已成为生产精细化学品,手性药物,食品添加剂等的重要工具,获得了广泛应用.随着酶催化应用范围的不断扩大和研究的逐步深入,研究者发现,酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求,而且天然酶的稳定性差,活性低使催化效率很低,还缺乏有商业价值的催化功能天然酶的局限•天然酶的局限性源于酶的自然进化过程.现代生物工程的要求•能具备长期稳定性和活性能适用于水及非水相环境能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药物的原材料•如何利用相对简单的方法以达到对天然酶的改造或构建新的非天然酶就显得非常有研究意义和应用前景.•1993年,美国科学家ArnoldFH首先提出酶分子的定向进化的概念,并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶.定向进化•定向进化是模拟自然进化的过程，进行人工随机突变，并在特定的环境条件下进行选择，使进化朝着人们所需要的方向发展的技术过程。•分为分子定向进化和细胞定向进化细胞定向进化•细胞定向进化是在细胞水平上进行定向进化的过程，以各种细胞为进化对象，目的是改良细胞的各种特征，主要包括微生物细胞的定向进化、动物细胞的定向进化、植物细胞的定向进化等。•随机突变方法有全基因组重排技术。•基因组重排技术通过把诱变与细胞融合技术相结合，对细胞进行基因组重排，从而大幅度增加细胞的正突变频率。分子定向进化•分子定向进化是在分子水平上进行定向进化的过程。•分子定向进化首先要通过从细胞内提取或者通过PCR等方法获得目标分子的基因，在体外采用易错PCR、ＤＮＡ重排、基因家族重排等技术进行人工突变，然后进行定向选择而获得所需突变体。酶分子定向进化•简称酶定向进化，是模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特征的酶的突变体的技术过程。酶定向进化的基本过程•随机突变、构建突变基因文库、定向选择•酶定向进化的基本过程：酶基因随机突变构建突变基因文库筛选负突变基因正突变基因进化酶反复进行•随机突变的策略易错PCR技术(error-pronePCR)DNA改组(DNAshuflling):由美国Stemmer于1994年首次提出一项体外重组技术随机引发重组(RPR)1998年,Arnold提出了一种有效的新方法交错延伸技术(StEP):由Zhao等提出,是一种简化的DNAshuffling技术基因家族重排技术•酶定向进化的特点1适应面广2目的性强3效果显著第二节酶基因的随机突变•体外随机突变的方法：PCR技术、DNA重排技术、基因家族重排技术•基因随机突变方法的特点P207表8－1•随机突变方法可以联合使用，交叉进行，通过多次试验，反复筛选，以完成对酶的定向进化。一易错PCR技术•在PCR技术的基础上，通过改变反应条件，增加碱基配对错误的出现频率，就成为易错PCR技术。•可以通过提高镁离子浓度、添加一定浓度的锰离子、改变4种底物（dAMP、dTMP、dCMP、dGMP）的浓度比等反应条件，使DNA聚合酶在催化基因扩增时，增加碱基配对错误的出现频率，而引起基因突变。特点•正突变的概率低，突变基因文库较大，文库筛选的工作量大，一般适用于较小基因的定向进化。二DNA重排技术•概念：又称为DNA改组技术，是从正突变基因文库中分离得到的同源DNA，用酶切割成随机片断，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。DNA重排技术的基本过程两条以上正突变基因DNA随机片断突变基因构建突变基因文库筛选负突变基因正突变基因进化酶酶切（反复进行）无引物PCR基因重组酶切•DNA重排技术将两条或多条正突变基因通过脱氧核糖核算酶Ⅰ（DNaseⅠ)等酶的作用，随机切割成若干DNA片断，然后将这些随机片断在不加引物的条件下经过多次PCR循环，使这些DNA随机片断互为模板和引物进行扩增、延伸，再加入适宜的引物进行PCR反应，获得全长基因。•这些全长基因由于是在不加引物的条件下由DNA随机片断互为模板和引物扩增而成的，其碱基序列经过重新排布而形成众多的突变基因。•1）交错延伸PCR技术：在同一个反应体系中以两个或多个相关的DNA片断为模板进行PCR反应，把PCR反应中常规的退火和延伸合并为一步，并且大大缩短了反应时间（55℃，5s)。在反应过程中，引物先与一个模板结合，进行延伸，随之进行多次变性和短时的退火－－延伸反应循环，在每个循环中，不同长度的延伸片断在变性时与原先的模板分开，退火时与另一个模板结合，再进行延伸。通过在不同的模板上交替延伸，所合成的DNA片断中包含有不同模板上的信息，直到获得全长的突变基因为止。•2）随机引物体外重组技术•采用单链DNA为模板，配合若干条随机序列的引物进行PCR反应，产生若干个与模板不同部分的序列互补DNA小片断，然后除去模板，这些DNA小片断互为模板和引物进行扩增，通过碱基序列的重新排布而获得全长突变基因。三基因家族重排技术•概念•又称为基因家族改组技术，是从基因家族的若干同源基因出发，用酶(DNaseⅠ)切割成随机片断，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列发生重新排布而引起基因突变的技术过程。基因家族重排技术的基本过程基因家族若干同源基因酶切DNA随机片断突变基因突变基因文库基因重组筛选负突变基因正突变基因进化酶无引物PCR酶切反复进行DNA家族重排技术与DNA重排技术的异同点•相同点：DNA家族重排技术与DNA重排技术的过程大致相同，都要经过基因的随机切割、无引物PCR等步骤以获得突变基因，然后经过构建突变基因文库、采用高通量筛选技术筛选获得正突变基因。•不同点：DNA家族重排技术从基因家族的若干同源基因出发进行DNA序列的重新排布，而后者则从采用易错PCR等技术所获得的两个以上的正突变基因出发进行DNA序列的重新排布。第三节酶突变基因的定向选择•突变基因的定向选择基本过程突变基因基因载体突变基因文库基因重组筛选目的基因一酶突变基因文库的构建•（一）构建基因文库的质量要求•1文库的包容性:指构建的文库必须尽可能地包含基因的任何一种可能的突变信息。•2文库的完整性：指文库中包含的DNA片断必须尽可能完整地反应基因的结构和功能信息，以便通过筛选得到的突变基因能够通过表达获得完整的具有催化功能的进化酶。（二）构建突变基因文库的主要过程•载体的选择1）质粒载体：微生物细胞染色体外，闭合环状双链DNA分子。2）噬菌体DNA载体：由噬菌体DNA改造而成的具有自我复制能力的载体。3）黏粒载体：是一类人工构建的含有λDNA黏性末端和质粒复制子的质粒载体，又称为柯斯质粒。4）噬菌粒载体：是一类人工构建的由M13噬菌体单链DNA的基因间隔区与质粒载体结合而成的基因载体。基因重组在体外通过DNA连接酶的作用，将基因与载体连接在一起形成重组DNA的技术过程。黏性末端连接平头末端连接修饰末端连接形成基因文库将重组DNA转入受体细胞或包装成有感染活性的噬菌体的过程。重组质粒载体：转化重组噬菌体DNA载体：需要用噬菌体外壳蛋白将重组DNA进行包装，称为有感染活性的重组噬菌体，而形成基因文库。二突变基因的筛选•（一）定向选择环境条件的设定•（1）提高酶的稳定性，高温筛选重组细胞，每一次突变－筛选的循环中逐步提高重组细胞的培养温度。•（2）如果定向进化的目的是提高β－内酰胺酶的活性，从而提高对β－内酰胺酶类抗生素的耐受性，可以通过在含有一定浓度的β－内酰胺酶类抗生素的培养基中培养重组细胞，并在每一次突变－筛选循环中逐步提高抗生素的浓度。•（二）高通量筛选技术P217表8－2一平板筛选法•平板筛选法所依据的重组细胞的表型包括细胞生长情况、颜色变化情况、透明圈情况。1）依据细胞生长情况筛选突变基因在提高酶的热稳定性、抗生素耐受性、pH稳定性和对其他极端环境条件的耐受能力等方面有广泛应用。2）依据颜色变化筛选突变基因（1）在采用噬菌体DNA载体构建突变基因文库时，可以用大肠杆菌β－半乳糖苷酶的基因片断（lacZ′）插入到噬菌体DNA的间隔区域中，当它感染了相应的大肠杆菌宿主细胞时，在含有IPTG和底物X－gal的平板培养基上可以形成蓝色噬菌斑。（2）在对磷酸酯酶进行定向进化的过程中，可以在平板培养基中加入硝基酚磷酸，接种重组细胞培养一段时间后，有些重组细胞周围出现黄色（硝基酚）。3）依据透明圈情况筛选突变基因依据透明圈情况筛选突变基因是在平板培养基中加入目的酶的作用底物，然后接种重组细胞，在一定条件下进行培养，培养一段时间后，在一些重组细胞的菌落周围会出现较大的透明圈。第四节酶定向进化的应用•P221表8－3一、提高酶的催化效率二、增加酶的稳定性三、改变酶的底物特异性思考题1何谓酶的定向进化？有何特点？2酶基因随机突变的三种方法？3易错PCR技术的概念及其主要过程。4DNA重排技术的概念及其主要过程。5基因家族重排技术及其主要过程。