细菌菌落总数的测定.

国家职业教育水环境监测与治理专业教学资源库国家职业教育水环境监测与治理专业教学资源库细菌菌落总数的测定周小林副教授水处理微生物知识点国家职业教育水环境监测与治理专业教学资源库教学内容1.细菌总数是水质污染的重要指标；2.稀释平板培养法；3.检测各环节操作规范。细菌菌落总数的测定国家职业教育水环境监测与治理专业教学资源库教学目标（1）知识目标•水质污染与细菌总数的关系；•平板培养计数原理；•样品稀释的方法；•平板制作与培养方法•计数与报告方式。（2）技能目标•掌握样品稀释的操作方法；•熟练进行无菌操作；•规范制作平板；•能正确控制培养条件；•能正确计数与报告。（3）素质态度要求态度端正，积极主动学习，严守操作规范，团结协作。细菌菌落总数的测定国家职业教育水环境监测与治理专业教学资源库一、细菌总数是水质污染的重要指标细菌数量与污染程度间具有相关性。水体污染主要涉及生活污水、人畜粪便、农业生产污染、工业污染等，污染物质中除去部分工业污染物外大多利于细菌的生长。污染物质的直接检测有较大的困难，而细菌检测相对容易，因此常用细菌数量作为水质状况的主要指标之一。对于不利于细菌生长的污染物，常需检测对应专门微生物及污染物含量的直接检测。细菌菌落总数的测定国家职业教育水环境监测与治理专业教学资源库二、稀释平板培养计数法细菌的个体微小，直接观察、计数困难；单个细菌经过培养可长成肉眼可见的菌落；要设法避免多个细菌长成1个菌落，常需对样品进行稀释处理。稀释平板培养菌落细菌菌落总数的测定国家职业教育水环境监测与治理专业教学资源库1.测定的程序：样品稀释接种平板培养菌落计数报告细菌菌落总数的测定国家职业教育水环境监测与治理专业教学资源库2.材料准备：培养皿、试管、移液管、锥形瓶等玻璃器皿的灭菌；制作营养琼脂培养基：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂15g，水1000mL；pH7.4~7.6，121℃灭菌15min。制备无菌水。细菌菌落总数的测定国家职业教育水环境监测与治理专业教学资源库3.无菌操作（1）保证除样品外所有需使用的材料无菌（2）无菌操作环境净化工作台：紫外灯提前开放0.5h以上，放入样品与材料需70%酒精表面消毒开放空间：减小空气流通（闭窗、减少人员走动等）；喷洒70%酒精净化空间；在酒精灯火焰上方无菌区操作（高度以不烫手为宜）净化工作台酒精灯无菌区操作细菌菌落总数的测定国家职业教育水环境监测与治理专业教学资源库（3）无菌操作规范试管、锥形瓶等无菌用具在无菌区打开，在此范围外必需封闭（基本原则），在无菌区外污染后不得再次使用；接种工具、涂抹棒等灭菌后即时在无菌区使用，区外污染后需再灭菌使用（注意灭菌后需在无菌区冷却后使用，以免烫死微生物而取不到到活的微生物）。细菌菌落总数的测定国家职业教育水环境监测与治理专业教学资源库1.分装无菌水取数支无菌试管，标记10－1、10－2、……,每试管分装9ml无菌水或无菌生理盐水。（也可分装好后再灭菌）稀释所需的数量级根据样品中微生物量的估计而定，一般轻度污染水稀释到10－3，重度污染水可稀释到10－5、10－6。三、样品的稀释主要针对样品中含较多微生物的水样（水源水、污水）；自来水、饮用水一般不需稀释，可直接取样培养。细菌菌落总数的测定国家职业教育水环境监测与治理专业教学资源库2.梯次稀释取混匀水样1ml放入标记10－1试管中，充分振荡混匀，得10－1稀释液；取10－1稀释液1ml放入标记10－2试管中，充分振荡混匀，得10－2稀释液；……，依次稀释到所需稀释浓度。细菌菌落总数的测定国家职业教育水环境监测与治理专业教学资源库3.注意事项取液量保证准确；稀释样要充分混匀；保证无菌操作（防止外源污染），但加样时注意不要太近火焰（杀死其中微生物）。混匀器细菌菌落总数的测定国家职业教育水环境监测与治理专业教学资源库1.培养数量不稀释样：样品、无菌水（无菌对照），共2个培养，每个培养需培养3个平板（重复）；需稀释样：最大稀释样及前两个稀释样、无菌水，共4个培养，每个培养需培养3个平板（重复）；预先在培养皿底面标记清楚培养稀释度、操作人、时间等信息。四、接种培养培养皿标记细菌菌落总数的测定国家职业教育水环境监测与治理专业教学资源库2.接种平板2.1混合平板法取各稀释样（无菌水）1ml放入无菌培养皿中，3个重复（可在稀释的操作同时取）；倒入适温培养基（50℃左右，冷却到不烫手为宜），每皿培养基倒入量一般9cm培养皿15ml左右（培养皿平放时倒入一半至2/3面积左右）；混匀（倒培养基时培养皿适度倾斜，桌面适度旋转，但不得使培养基附着到培养皿侧面）；静置冷却成平板，翻转放置。细菌菌落总数的测定国家职业教育水环境监测与治理专业教学资源库2.2平板涂布法先制作平板；取样品（无菌水）0.1ml放入平板上，涂抹棒均匀涂抹平板表面，直至无残存样品（无菌水）；翻转放置。平板涂布细菌菌落总数的测定国家职业教育水环境监测与治理专业教学资源库2.3注意事项保证无菌操作要求，同时注意不得影响样品中的微生物（培养基不得太烫，取样时不要离火焰太近）；制作平板时培养基不得沾附底面之外的侧面甚至盖上，未凝固前不得翻转；不同稀释度不得使用同一移液管，防止交叉影响及污染；平板涂布法中，最好先在净化工作台中提前制作平板，并放置一段时间（2d左右），以使表面稍干燥便于涂布。细菌菌落总数的测定国家职业教育水环境监测与治理专业教学资源库3.培养培养温度为36℃，培养时间24h；选用普通电热恒温培养箱，也可选用生化培养箱或霉菌培养箱；平板培养基一面朝上，不可颠倒；根据培养时间要求及时取出进行后续处理。细菌菌落总数的测定国家职业教育水环境监测与治理专业教学资源库1.菌落计数方法观察方法：直接肉眼观察计数，必要时用放大镜、菌落计数仪观察，防止遗漏。特殊情况的处理：若某平板有较大片状菌落生长且超过一半面积时，此平板则不宜作计数用；片状菌落小于一半面积，且其余菌落分布又很均匀时，可取平板一半面积计菌落数，再乘以2得本平板菌落数。五、菌落计数与报告细菌菌落总数的测定国家职业教育水环境监测与治理专业教学资源库2.不同稀释度的选择与报告细菌菌落总数的测定国家职业教育水环境监测与治理专业教学资源库3.报告方式菌落数在100以内，按实际数据报告；大于100时，采用2位有效数字，在有效数字后的位数，以四舍五入方法计算；数值较大时，数字后可用10的指数表示。细菌菌落总数的测定国家职业教育水环境监测与治理专业教学资源库四、任务考核考核内容考核指标分值总体操作程序是否清楚、规范15材料准备及器皿标记材料准备种类、数量，培养皿、试管的标记15无菌操作规范是否在无菌操作区操作、可能污染等不规范操作20稀释取液量的准备、加样顺序、是否混匀等15平板制作培养皿打开规范、是否混匀、平板质量等15培养平板是否倒置、培养条件控制10计数与报告计数、报告方法是否正确10细菌菌落总数的测定国家职业教育水环境监测与治理专业教学资源库谢谢！