第05章 细胞培养dun

第五章细胞培养5.1原代细胞的培养与维持5.2原代细胞培养的传代5.3细胞的纯化5.4细胞的克隆化5.5细胞的形态观察•细胞培养技术也叫细胞克隆技术。不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养，既包括微生物细胞的培养，细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且细胞培养本身就是细胞的克隆。通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。因为生物产品都是从细胞得来，所以可以说细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。消化初代培养法如左图。对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。5.1原代细胞的培养与维持原代细胞（primaryculturecell）是指从机体取出后立即培养的细胞。有人把培养的第1代细胞与传10代以内的细胞统称为原代细胞培养。①静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞)的培养的起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮。②若原代贴壁细胞不是用于长期培养，只是用于分离繁殖或测定病毒之用，其细胞浓度可以加大，尽量贴成厚层以利病毒的效价提高和测定结果（如空斑）更加明显、准确。③待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状，此时的pH若有明显变化，应将原代细胞换液，即倒去旧液，换入与原培养液相同的等量新鲜的培养基，以便除去衰老、死亡的细胞和陈旧的培养基，使贴壁细胞能获得充足的营养。④若希望细胞能在较长时间内能维持存活，但不需增殖，此时要换成含血清低的维持液。⑤悬浮细胞：凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及白血病细胞等悬浮细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞。待细胞开始增殖甚至结成小团块，培养基中pH变酸，说明细胞生长繁殖良好。一般每隔3天需半量换液一次（换液时尽量使细胞不丢失）。待细胞增殖加快，浓度明显增加，pH发生明显变化时，此时可考虑传代。传代一定要待细胞密度较高时才能进行，以防传代失败。5.2原代细胞培养的传代（Subculture）原代培养后由于细胞增殖，数量增加甚至达饱和密度，贴壁细胞的相互汇合，使整个瓶底逐渐被细胞覆盖，细胞难以继续生长繁殖，需要进行分瓶培养，即传代。每进行一次分离再培养称之为传一代，传至5～10代以内的细胞通常称为次代培养细胞，传至10~20代以上的细胞，通常确定为传代细胞（或称传代细胞系）。传代细胞系的建立的关键是初代培养的首次传代。原代细胞经传代后所形成的传代细胞，可根据不同细胞采取不同的方法进行传代。贴壁生长的细胞用消化法传代，部分贴壁的细胞用直接吹打或用硅胶软刮的刮除法传代。悬浮细胞可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行传代，或用自然沉降法加入新培养基后再吹打分散进行传代。随后细胞系的维持是通过换液传代再换液、再传代和细胞种子冻存来实现的。传代时注意事项：(1)细胞生长密度不高时，或未能达到覆盖整个瓶底时不能急于传代；(2)原代培养的贴壁细胞多混杂细胞，形态各异，用胰蛋白酶消化时要掌握好消化时间；(3)吹打已消化的细胞要轻巧，既不能听到有明显的吹打声，又不能有大量泡沫在悬液中形成，以尽可能减少对细胞的机械损伤；(4)首次传代时细胞接种数量要多一些，以利于细胞的生存和繁殖，如果消化分离的细胞悬液有组织块，也一并传入到培养瓶，尽量减少细胞损失；(5)首次传代培养时的pH不能高，宁可偏低一些。此外，小牛血清浓度可适当加大。5.3细胞的纯化一般分为两种：自然纯化和人工纯化。（1）自然纯化利用某一种类细胞的增殖优势，在长期传代过程中靠自然淘汰法，不断排挤其他生长慢的细胞，靠自然增殖的潜力，最后留下生长优势旺的细胞，达到细胞纯化的目的。这种方法常无法按照需要和实验要求及目的来选择细胞，花费时间长，留下来的往往是成纤维细胞。恶性变异的肿瘤细胞或突变的细胞可以通过此方法而保留下来，不断纯化而建立细胞系。（2）人工纯化利用人为手段造成某一细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞的生长从而纯化细胞。①细胞因子依赖纯化法指人和动物组织中某些细胞需要有特殊的细胞因子存在的微环境才能长期存活和生长繁殖，如：IL-2是T细胞生长所必需的细胞因子，BCGF是B细胞的生长因子。②酶消化法是比较常用的纯化方法，对于贴壁细胞，能利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，使两者分开，达到纯化的目的。酶消化法对贴壁细胞与半贴壁及粘附细胞间的分离纯化也是十分有效的。例：骨髓基质肌样细胞的纯化在血液细胞和骨髓细胞静置培养时，常有许多肌样细胞和骨髓基质细胞贴壁生长，但也有许多淋巴细胞、单核细胞、粒细胞粘附其上，种类混杂。鉴于粘附细胞贴壁不牢固，可用酶消化法使粘附细胞脱壁分离，以达到骨髓基质细胞或血液中肌样细胞与淋巴细胞分开和纯化的目的。③机械刮除法指在原代培养时，如果上皮细胞和成纤维细胞为分区成片混杂生长，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上，可采用机械的方法去除不需要的细胞区域而保留需要的细胞区域。④反复贴壁法一般指成纤维细胞与上皮细胞相比，其贴壁过程快，大部分细胞能在短时间内（约10~30min）完成附着过程，而上皮细胞在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，利用此差别可以纯化细胞。⑤电烙筛选法是在贴壁细胞转化时，往往在培养瓶的细胞层中会出现分散的转化灶，转化灶区域细胞密集、排列规则，有明显生长趋势，与周边未能转化的细胞有明显的区域界限，此时即可用机械刮除法去除未转化细胞，也可用电烙筛选法烫死未转化细胞而保留转化灶细胞。5.4细胞的克隆化①细胞克隆技术又称单个细胞分离培养技术，即从细胞群体中分离出一个细胞，并使其在体外培养体系中能繁殖成新的细胞群体，这种由单个细胞所形成的细胞群（或集落）称为一个克隆，这种纯化后的细胞群体称为细胞株。②细胞株中每个细胞的遗传特征和生物学特性极为相似和一致，利于对不同群体细胞的形态和功能进行比较和研究。若该细胞株只是一般传代、无一系列实验鉴定指标，则为一般细胞株。若有一系列实验指标报道的，则称为限定性细胞株，如由幼地鼠肾细胞系（BHK21）第13孔的单个细胞形成的细胞株称BHK-21C-13（代表克隆13），其形态规则，特性稳定，便于研究。③单一细胞体外培养能否形成克隆，这与各细胞克隆形成率有关，如果细胞克隆形成率偏低（小于10%）应采用一些措施：如改用胎牛血清，适应性培养基添加刺激因子（如胰岛素、地塞米松、细胞生长因子等），调节CO2浓度以控制pH。④若贴壁效果差可选用适当的适应性底物（如胶原层或血浆纤维蛋白层），以及制备底层的饲养细胞。用X线或60Co照射处理的细胞层，如鸡胚细胞、骨髓基质细胞，该细胞照光后只有代谢功能，无增殖和传代能力，或选用短寿的细胞，常选用鼠腹水巨噬细胞作饲养细胞，用于单克隆抗体杂交瘤细胞的克隆化。A、毛细管法：将一定量的细胞悬液（如105/mL或更低）稀释至1个细胞/mL，取10mL稀释的细胞悬液。用直径为0.5mm，长为8mm的毛细玻璃管若干（30～50只），在负压作用下，使悬液吸入各毛细管中。在倒镜下检查出每管只进入一个细胞的毛细管，然后放入适应性培养基或有饲养层细胞的培养瓶（或培养板）内，在CO2培养箱中培养，由一个细胞在毛细管繁殖后，并向管外扩展，并形成单个克隆的细胞群体。B、有限稀释法•有限稀释法采用梯变倍数稀释的原则，将稀释的细胞悬液接种于微孔培养板中（也可在板上的96孔中直接稀释）培养一定时间后，孔中可出现单个细胞克隆，本法不需特殊设备，操作简单快速，适合大批量克隆化培养。现已广泛用于异质性细胞系的克隆化培养、诱导和分离耐药性或高转移性、或突变细胞株以及单克隆抗体杂交瘤细胞株的克隆筛选中。C、平皿克隆分离法将对数生长期细胞制备单个细胞悬液计数，调整细胞浓度，使5mL培养液内含有50～200个细胞。将细胞悬液迅速移入60mm平皿中，培养1周或更长。若有明显的克隆形成时进行克隆分离。克隆分离方法：①套环法：在倒置显微镜下观察克隆形成的情况，标记单个克隆周边，吸干培养基，用涂有少量无菌硅脂的无菌金属套环，套住标记的克隆，在套环内滴加少量0.25%胰蛋白酶，待细胞脱离时，用注射器针头轻轻吹打分散后，转入小平皿或24孔板或6孔板中扩大培养。②玻片法：在接种细胞悬液前，预先在60mm平皿中放入无菌小玻片，加入细胞悬液，培养一定时间后，在倒置显微镜下标记上含一个克隆的玻片，然后用无菌镊子取出标记玻片转入24孔培养板中继续培养。D、软琼脂克隆分离法仅适用于悬浮培养的类淋巴细胞或恶性程度高的贴壁细胞。正常贴壁细胞在软琼脂中不能形成克隆。(1)将对数生长期的细胞制成单个细胞悬液。调整细胞浓度至1×106/L，然后根据实验要求再作梯倍稀释。通常以1×104~5×104个细胞/L为佳。(2)制备底层琼脂：取5%琼脂置沸水中，使琼脂完全溶化，移入小烧杯中，待冷至50℃，迅速加入9份预温37℃的新鲜培养液（即成为0.5%琼脂），混匀后立即注入24孔培养板中，0.8mL/孔，室温使琼脂凝固备用（此层也可以省略）。(3)制备上层琼脂：取37℃保温的、不同浓度的细胞悬液9.4mL，移入小烧杯中，加入50℃5%琼脂0.6mL迅速混匀，即配成0.3%琼脂培养基，立即浇入铺有底层琼脂的24孔培养板中，0.8mL/孔，置室温使琼脂凝固。(4)于37℃5%CO2下培养1~2周或更长，若需培养更长时间可补加0.8mL/孔含琼脂的培养液，待有明显集落形成为止。(5)集落（克隆）计数：在倒置显微镜下观察并计数直径大于75μm或含有50个细胞以上的克隆。%100%每皿接种细胞数生成克隆数）克隆）形成率（集落（%1002%个以上细胞群数目单个细胞的数目单个细胞的数目）单个细胞百分率（E、单细胞显微操作法借助显微操纵器，在显微镜监控下将单个细胞逐个吸出，移入含有饲养层细胞的培养板中进行培养。本法准确性好，如无显微操纵器可自制毛细吸管替代。（1）制备饲养层细胞（2）制备单个细胞悬液（3）分离单个细胞（1）制备饲养层细胞（以小鼠纤维细胞3T3为例）①用0.25%胰蛋白酶消化单层贴壁生长的3T3细胞，调整细胞浓度为108细胞/L，在96孔板中每孔加入0.1mL细胞悬液于37℃5%CO2中培养至单层。②将已形成单层的3T3细胞板，用60Coγ线以4000～6000拉得辐射或在培养液中加入丝裂霉素（终浓度为10-6mol/L）作用16h。使细胞有丝分裂能力丧失，但仍可短期存活，有代谢功能，不仅可维持pH而且还可为克隆细胞提供必要的养分及刺激生长的因子。饲养细胞处理后需更换新鲜培养液。（2）制备单细胞悬液分离单个细胞：①毛细管吸入法；②微滴法；③液体石蜡法；④玻璃小球附着法。（3）将单个细胞，放入预先制备饲养层细胞的96孔培养板中，于37℃5%CO2下培养1~2周或更长。（4）待细胞克隆明显，并使孔底覆盖1/3～1/2时，即可将细胞转种于24孔板进行扩大培养。单细胞克隆示意图5.5细胞的形态观察在一般光镜下直接观察培养细胞，细胞功能健康活跃时，细胞呈现均质而透明的，结构极不明显。用相差显微镜可看清细胞的轮廓和内部结构。细胞有1~2个核仁。用固定染色法和特殊技术可显示细胞器等结构。细胞功能状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。在胞质中出现颗粒、脂滴和空泡等，反差很大的暗色小颗粒是变形的线粒体，这些是细胞代谢不良的表现。细胞膜下胞质区中有微丝、微管构成的骨架系统(cytoskeletonsystem,CSS)，正常培养细胞中的微丝和微管走行有一定方向性，细胞转化后走行紊乱，被视为一项检测的标志。功能状态良好的细胞中的线粒体，呈杆状或卵圆形，数量较多，当代谢不良或细胞功能低下时，其胞内有颗粒形成，并集聚成大的团粒，在光镜下也明显可见。培养细胞的形态与细胞在体外生存时间的长短、细胞种类有一定关系。初代培养的正常二倍体