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当前位置:首页 > 商业/管理/HR > 经营企划 > 第二章质粒DNA的微量提取(SDS法)案例
实验二质粒DNA的微量提取碱裂解法(SDS法)一.目的与要求通过质粒的一些基本特性、质粒DNA的提取技术,学习用碱变性法提取质粒DNA的方法。二.相关知识质粒(Plasmid):独立于染色体外的,能自主复制且稳定遗传的遗传因子。绝大多数是一种环状的双链DNA分子。广泛存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中,在细菌细胞中最多。细菌质粒是用的最多的质粒类群,其大小从1Kb-200Kb,它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。质粒DNA的存在区域和结构特征电镜中质粒DNA的形态•严谨型:质粒的复制受到寄主细胞严格控制,与寄主细胞的复制偶联同步。因此,在一个细胞中只有1个或几个拷贝;•松驰型:质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的,每个细胞中含有10-200个拷贝。用一定的药物处理,抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。质粒pBR322即属于松弛型质粒,要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。质粒类型:载体(Vector):用于携带重组DNA,并且能够使外源DNA一起复制或表达的质粒(运载工具)。具备的条件:1.具备条件(1)易于鉴定;(2)在受体细胞中可以独立复制;(3)易于筛选;(4)易于导入受体细胞。2.结构特征(1)抗性基因(Ampicillingene,Kanamycinegene)(2)启始复制子(ori);(3)多克隆位点(MSC);(4)标记基因(LacZgene)。InsertEcoRIXhoI1.9kbDNA是具有一定结构的物质,特殊的环境会导致DNA的变性,如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等,而适宜的环境又可以使DNA复性。三.原理:SDS是一种阴离子表面活性剂,既能使细菌细胞裂解,又能使一些蛋白质变性,所以SDS处理细菌细胞后,会导致细菌细胞壁的破裂,从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性(NaOH)环境,就会变性。然后,用酸性乙酸钾中和溶液,使溶液处于中性,质粒DNA将迅速复性,而基因组DNA,由于分子巨大,难以复性。离心后,质粒DNA将在上清中,而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。四.细菌裂解的方法:(1)碱裂解法:0.2molNaOH+1%SDS;(2)煮沸裂解法:沸水煮沸40s;(3)SDS裂解法:10%SDS,用于质粒大量提取。五.DNA浓度的测定:(1)分光光度计法:碱基(G,A,T,C)在260nm处具有强吸收峰,一般在中性pH值左右的环境中进行测定。这种方法常测定比较纯的样品。(2)荧光的强度法:(3)凝胶电泳比对法,与标准分子量相比较。六.材料和仪器1.材料:含有质粒P3.5K-EGFP的大肠杆菌DH5α。P3.5K-EGFP是一种酵母荧光表达载体,常用于检测酵母中外源基因表达强度和亚细胞定位。2.试剂:裂解液一,裂解液二,裂解液三,酚氯仿,异丙醇,70%乙醇,TE等。3.仪器设备:高速离心机,移液器,摇床等4.加入400l新配制的裂解液二,加盖颠倒6-7次使之混匀,放置3-5min(不得超过5min);七.质粒微量提取的方法培养细菌收集菌体悬浮菌体裂解菌体1.将带有质粒的DH5a接种到3-5ml含有amp抗生素的液体培养基,37℃培养12-16h;2.取液体培养液1.4ml于Ep管中,10000rpm离心1min,去掉上清液,重复步骤2;最后瞬时离心后,用移液器去除上清。(所有去除残液均用此法)3.加入200l裂解液一,涡旋混匀放置5min;5.加入300L裂解液三(乙酸钾溶液),加盖后颠倒6-7次混匀,放置3-5min;中和复性6.用台式高速离心机,12000rpm离心10min。离心除杂12.将分离出的质粒DNA置于-20℃保存备用。9.沉淀用0.5mL70%乙醇清洗一次,12000rpm离心5min,弃上清,重复9;11.加入20-30l含有20g/mlRNase的ddH2O或TE溶解,室温放置15-30min,使DNA充分溶解.去蛋白沉淀洗涤7.将700L上清移入另一干净离心管,加入等体积的酚、氯仿(700ul),混匀。12000rpm离心10min。10.瞬时离心,用移液器将管底残余液体移除,小管倒置于吸水纸上,室温自然干燥至透明;样品干燥样品溶解样品保存8.取600L上清到另一离心管中,加入等体积冰冻异丙醇,混匀,12000r/min离心5min,弃上清;离心收集(1)取2l提取的质粒DNA,加入98L蒸馏水对待测DNA样品做1:50(或更高倍数的稀释);(2)蒸馏水作为空白,在波长260nm、280nm处调节紫外分光光度计读数至零。(3)加入DNA稀释液,测定260nm及280nm的吸收值,并记录。(4)通过计算确定DNA浓度或纯度,浓度单位为g/ml,dsDNA=50×(OD260)×稀释倍数补充内容—1.用分光光度计法定量DNA260nm读数用于计算样品中核酸的浓度,OD260值为1相当于约50g/ml双链DNA,33g/ml单链。可根据在260nm以及在280nm的读数的比值(OD260/OD280)估计核酸的纯度。一般DNA的纯品,其比值为1.8,低于此值说明有蛋白质或其它杂质的污染。补充内容—2.凝胶电泳检测DNA的浓度实验步骤实验步骤见下一个试验—《琼脂糖凝胶电泳技术的原理和方法》结果1%的琼脂糖凝胶,90V,40分钟。•NEB标准分子量片段(1kbDNALadder)1kbDNALadder虽然不能对DNA质量进行精确定量分析,但可以通过与相近的条带进行比较估算出大概的数据。片段碱基对质量110,00242ng28,00142ng36,00150ng45,00142ng54,00133ng63,001125ng72,00048ng81,50036ng91,00042ng10a51742ng*10b50042ng*0.5kb的条带由500bp和517bp组成,这样即使在低分子量区域条带的强度也比较均一。按0.5μg上样量计。应按13条带计算,因为3kb的量是其它片段量的近三倍存在的问题及注意事项1.无DNA沉淀或沉淀少:(1)不含有质粒;(2)裂解液2失效;(3)异丙醇沉淀时没有混匀。2.加入裂解液后存在不裂解团块:涡旋过程不彻底。3.沉淀干燥后不透明:沉淀的DNA含有大量杂质。4.沉淀干燥后有颜色:取上清时取到了有机相。5.电泳时条带不清晰:(1)菌体中不含质粒;(2)裂解时间过长;(3)没有去掉RNA。6.电泳时条带拖尾:(1)电压过大;(2)操作过程中太剧烈,出现了断裂;(3)缓冲液过时。人有了知识,就会具备各种分析能力,明辨是非的能力。所以我们要勤恳读书,广泛阅读,古人说“书中自有黄金屋。”通过阅读科技书籍,我们能丰富知识,培养逻辑思维能力;通过阅读文学作品,我们能提高文学鉴赏水平,培养文学情趣;通过阅读报刊,我们能增长见识,扩大自己的知识面。有许多书籍还能培养我们的道德情操,给我们巨大的精神力量,鼓舞我们前进。
本文标题:第二章质粒DNA的微量提取(SDS法)案例
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