黄曲霉毒素的简介和快速检测方法

黄曲霉及其毒素姓名：蒋玲珊学号：070601215喝奶粉，害怕三聚氰胺；食海鲜，害怕甲醛；吃便饭，害怕“地沟油”……据调查，“地沟油”的酸败指标远远超出国家规定，长期摄入，人们将出现体重减轻和发育障碍，易患腹泻和肠炎，并有肝、心和肾肿大以及脂肪肝等病变。此外，地沟油受污染产生的黄曲霉毒性不仅易使人发生肝癌，在其他部位也可以发生肿瘤。2004年一些国内花生出口企业、阿尔及利亚花生进口商和部分瑞士、西班牙和荷兰的花生中间商接连给我驻阿使馆经商参处来电和来函，反映我国花生在阿港口因黄曲霉毒素超标而被拒绝进口的情况。2006年6月15日，西班牙在欧盟食品和饲料快速预警系统中通报我国产花生仁黄曲霉毒素超标。近年来我国黄曲霉毒素的案例•2010年12月24日，广东三水西南老牌油厂已停工整顿，原因是该厂一批次食用油被检出黄曲霉毒素严重超标，广东三水区食品安全委员会发布消息，证实三水粮食管理储备中心西南油厂生产的一批次“穗生”二级压榨油黄曲霉毒素超过国标50%。第四部分黄曲霉的防范措施第二部分黄曲霉毒素的危害第一部分黄曲霉毒素的性质及来源分布第三部分黄曲霉的检测内容摘要紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性.pH9-10的强碱溶液中分解迅速易溶于油,甲醇,丙酮和氯仿等有机溶剂沙门氏菌黄曲霉毒素的理化性质相对分质量312-346黄曲霉毒素的来源及分布•来源黄曲霉毒素是黄曲霉、寄生曲霉等产生的代谢产物。当粮食未能及时晒干及储藏不当时，往往容易被黄曲霉或寄生曲霉污染而产生此类毒素。•分布黄曲霉毒素存在于土壤,动植物,各种坚果,特别是花生和核桃中.在大豆,稻谷,玉米,通心粉,调味品,牛奶,奶制品,食用油等制品中也经常发现黄曲霉毒素.一般在热带和亚热带地区,食品中黄曲霉毒素的检出率比较高,在我国,产生黄曲霉毒素的产毒菌种主要为黄曲霉。黄曲霉毒素的危害黄曲霉毒素（Alfatoxin简称AFT或AT）是黄曲霉和寄生曲霉产毒菌株的代谢产物，是到目前为止所发现的毒性最大的真菌毒素，普遍存在于霉变的粮食和粮食制品中。黄曲霉毒素的致癌力强，十分耐热，加热到230度的时候才能完全破坏。•寄生曲霉的所有菌株都能产生黄曲霉毒素，并非所有的黄曲霉都是产毒菌株，即使是产毒菌株也必须在适合产毒的环境条件下才能产毒。黄曲霉毒素黄曲霉毒素的性质其中以B1的毒性和致癌性最强，它的毒性比氰化钾大100倍，仅次于肉毒毒素，是真菌毒素中最强的；致癌作用比已知的化学致癌物都强，比二甲基亚硝胺强75倍。黄曲霉毒素具有耐热的特点，裂解温度为280℃，在水中溶解度很低，能溶于油脂和多种有机溶剂。黄曲霉毒素B1（AFTB1）是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素），前者为基本毒性结构，后者与致癌有关。黄曲霉毒素M1（AFTM1）是AFTB1经动物代谢产生的衍生物，可以从内脏、尿和乳汁中测出。尿或乳汁中排出的AFTM1的量约为摄入AFTB1量的1％。AFTM1的毒性(鸭雏经口LD50≈0.32mg/kg)仅次于AFTB1，致癌性也相似。因此，乳及乳制品中AFTM1的污染控制是食品卫生工作的重要环节。产毒条件毒性温度范围是12~42℃，最适产毒温度为33℃。最适Aw值为0.93~0.98粮食水分为18.5%菌体形成孢子水果肉类黄曲霉毒素污染可发生在多种食品上蔬菜花生和玉米在收获前就可能被黄曲霉污染，使成熟的花生不仅污染黄曲霉而且可能带有毒素，玉米果穗成熟时，不仅能从果穗上分离出黄曲霉，并能够检出黄曲霉毒素。品名中国标准μg/kg（ppb)美国标准μg/kg(ppb)欧盟μg/kg(ppb)玉米、花生、坚果和干果（核桃、杏仁）≤20≤20≤2、4、5、8、10、15玉米及花生仁制品（按原料折算）≤20≤20≤2、4、5、8、10、大米、其它食用油（香油、菜子油、）≤10≤10≤2、4其它粮食（麦类、面粉、薯干）、发酵食品（酱油）≤5≤5不得检出牛乳及其制品≤0.5≤0.5≤0.05各国食品饲料中黄曲霉毒素允许量标准中毒症状黄曲霉毒素是一种强列的肝脏毒，对肝脏有特殊亲和性并有致癌作用。它主要强烈抑制肝脏细胞中RNA的合成，破坏DNA的模板作用，阻止和影响蛋白质、脂肪、线粒体、酶等的合成与代谢，干扰动物的肝功能，导致突变、癌症及肝细胞坏死。同时，饲料中的毒素可以蓄积在动物的肝脏、肾脏和肌肉组织中，人食入后可引起慢性中毒。中毒症状中毒症状分为三种类型：1）急性和亚急性中毒短时间摄入黄曲霉毒素量较大，迅速造成肝细胞变性、坏死、出血以及胆管增生，在几天或几十天死亡。2）慢性中毒持续摄入一定量的黄曲霉毒素，使肝脏出现慢性损伤，生长缓慢、体重减轻，肝功能降低，出现肝硬化。在几周或几十周后死亡。3）致癌性实验证明许多动物小剂量反复摄入或大剂量一次摄入皆能引起癌症，主要是肝癌。黄曲霉的检测亲合层析法酶联免疫吸附法微柱法高效液相色谱法放射免疫法薄层色谱法（TLC法）薄层色谱法（TLC法）TLC法是测定黄曲霉毒素的经典方法，是我国测定食品及饲料中ＡＦＴＢ1的标准方法之一（GB/T5009.23—1996）。其原理是将样品经过提取、柱层析、洗脱、浓缩、薄层分离后，在波长365nm紫外光下产生蓝紫色或黄绿色荧光，黄曲霉毒素B1、B2产生蓝紫色荧光，黄曲霉毒素G1、G2产生黄绿色荧光，并根据其在薄层上显示的最低检出量来确定其含量，是一种半定量检测技术。ＴＬＣ有单向展开法和双向展开法,其中双向展开法能进一步除去样品中的杂质，提高灵敏度。优点：ＴＬＣ法由于设备简单,易于普及,所以国内外仍在使用，TLC法较适合于对黄曲霉毒素的定性检测，是研究黄曲霉毒素初期所使用的主要方法。缺点：薄层色谱法对样品处理繁琐，且提取和净化效果不够理想，提取液中杂质较多，因而在展开时影响斑点的荧光强度，双向展开法虽避免了杂质干扰,但增加了操作步骤和时间。实验过程复杂，所需时间多，易受杂质干扰，准确性差，对实验人员危害大。酶联免疫吸附法（ELISA）•酶联免疫吸附法的基本原理：抗原(或抗体)吸附剂和用酶标记的抗体(或抗原)，与标本中的待测物(抗原和抗体)起特异的免疫学反应,用测定酶活力的方法来增加测定的敏感度,是一种定性或半定量的方法。大致采用两种方法检测黄曲霉毒素：一种是用双抗体夹心法；另一种是用竞争法。属于非竞争结合测定。它是检测抗原最常用的ELISA，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测。其基本工作原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。双抗体夹心法双抗体夹心法仪器双抗体夹心法操作步骤：•⑴将特异性抗体包被固相载体。孵育一定时间，使形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体和杂质。•⑵加待检标本，孵育，使标本中的抗原与固相载体上的抗体充分反应，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。•⑶加酶标抗体，孵育，使形成固相抗体-待测抗原-酶标抗体夹心复合物。洗涤除去未结合酶标抗体。•⑷加底物显色。固相上的酶催化底物产生有色产物,通过比色,测标本中抗原的量。双抗体夹心法：免疫吸附法测定的试剂盒及配套仪器、方法被列入国家标准（ＧＢ/Ｔ500922—1996第二法）[4]。Holladay等[5]采取间接ELISA技术，检测了抗黄曲霉毒素Ｍ1-牛血清白蛋白(AFTM1-BSA)免疫原的特异性AFTM1抗体。为了使用方便,利用酶联免疫原理研制出黄曲霉毒素快速测试盒，能简便地定量测定黄曲霉毒素含量。赵晓联等[6]应用这种快速测试盒测定黄曲霉毒素含量，先用三氯甲烷提取样品，过滤，收集并水浴挥干提取液，再用甲醇溶解，最后用专用黄曲霉毒素试剂盒测定。•竞争法ELISA可用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行检测。•其方法的特点是：①酶标记抗原（抗体）与样品或标准体中的非标记抗原或抗体具有相同的与固相抗体（抗原）结合的能力；②反应体系中，固相抗体（抗原）和酶标抗原（抗体）是固定限量，且前者的结合位点少于酶标记与非标记抗原（抗体）的分子量和；③免疫反应后，结合于固相载体上复合物中被测定的酶标抗原（抗体）的量（酶活性）与样品或标准品中非标记抗原（抗体）的浓度成反比。竞争法竞争法酶联免疫吸附法优点：特异性强、灵敏度高、成本低，适于批量检测，食品和饲料工业上可利用此方法来界定食品或饲料中黄曲霉毒素的超标问题。缺点：由于酶本身的不稳定性，用此方法检验黄曲霉毒素有可能带来假阳、阴性结果，复杂样品受干扰，检测准确度不高。所以研制出的黄曲霉毒素快速测试盒多以测定最具毒性的种属为主，酶联免疫吸附法的检测精度还有待于提高。放射免疫法与酶免疫法类似。但放射免疫法存在放射污染，已被淘汰。利用免疫化学原理，抗体选择性吸附抗原物质AFTB1，具有高灵敏、高选择、高特异性等特点,提高净化效果及检测灵敏度，减少有毒、有害试剂的使用，有利于操作人员的健康和环境保护。亲合层析法放射免疫法•HPLC是近几年发展起来的检测AFTB1方法,主要是用荧光检测器检测,在适宜的流动相条件下,采用反相Ｃ18柱,使多种黄曲霉毒素同时分离。高效液相色谱法（HPLC）优点：高效液相色谱法灵敏、分辨率高，可作定性、定量分析，同时可检测多个黄曲霉毒素种类，适于大批量样品的分析。缺点：设备昂贵，技术水平要求高，每次实验所使用的化学药剂和处理途径对试验结果影响程度差别很大，对实验结果的精度造成影响；样品还需进行繁琐的纯化处理，不适合快速检测。原理：将样品提取液通过由氧化铝与硅镁吸附剂组成的微柱层析管，杂质被氧化铝吸附，黄曲霉毒素被硅镁吸附剂吸附，在365nm紫外线下呈蓝紫色荧光，其荧光强度在一定范围内与黄曲霉毒素的含量成正比，由于微柱不能分离黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，故检测结果为黄曲霉毒素的总量。微柱筛选法测定黄曲霉毒素,主要是用来检验黄曲霉毒素的存在与否以及快速筛选出超标样品。要对黄曲霉毒素种类进行区分定量检验,则需要对不同黄曲霉毒素组分进行分离,再利用其它方法检测。因此,微柱筛选法并不能完成整个黄曲霉毒素的检测过程,仅适用于定性检验。微柱筛选法国内外现有黄曲霉毒素的检测产品及应用前景•黄曲霉毒素的检测目前多采用试剂盒检测法，因为试剂盒检测简便、费用低、快速，且能定量和定性。真菌毒素检测试剂盒的工作原理是薄层色谱法或免疫化学法。•将免疫亲和柱与高效液相色谱法结合应用,是目前采用较多的一种方法。这些新方法、新手段的快速应用，为黄曲霉毒素的检测提供了更广泛的选择余地，适应了不同的检测目的和要求。1.国外的检测试剂盒①RomerLabsInc.1301StylemasterDriveUnion,Missouri63084(314)583-8600，用于检测AFT、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮。每一个试剂盒能检测出3种真菌毒素。Romer‘s的真菌毒素检测使用的是TLC技术。②NeogenCorporation620LesherPlaceLansing,Michigan48912-1509(800)234-5333，用于检测AFT、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮、伏马毒素、T-2毒素和赭曲霉毒素。每一个AFT需要一个独立的试剂盒。Neogen的“AGRI-SCREEN”和“VERATOX”是使用ELISA技术。③Vicam29MysticAvenueSommerville,Massachusetts02145(800)338-4381，用于检测AFT、玉米赤霉烯酮、伏马毒素、赭曲霉毒素。每种真菌毒素需要一个独立的试剂盒，所需的其它试剂都要单独购买。Vicam's柱使用的是免疫亲和层析技术。•2.ELISA定量检测黄曲霉毒素B1试剂盒本试剂盒是以抗原-抗体反应为基础，采用免疫竞争法的原理建立的黄曲霉毒素定量检测试剂盒。•3.黄曲霉毒素免疫层析试纸条本产品是利用竞争性免疫分析原理设计，具有简单、快速、灵敏性高等特点，无需仪器设备配合测定，检测既可以在实验室中进行，也可以在农场、饲料混合车间等进行实地测定。4.黄曲霉毒素速测仪该系统由黄曲霉毒素B1测定仪主机、仪器专用试剂盒组