中国南方典型矿区浸矿细菌分离及其亚铁和硫氧化性能比较

何环，夏金兰，彭安安，邱冠周中南大学资源加工与生物工程学院，教育部生物冶金重点实验室，湖南长沙（410083）E-mail：[e-mail].摘要：本实验从中国南方典型矿区—广东梅州玉水生物提铜示范基地酸性矿水中分离得到三株嗜酸氧化亚铁硫杆菌YS-I，YS-II，YS-III。对分离得到的菌株形态学、16SrDNA的序列、以及对亚铁和硫的氧化性能进行了比较分析，并且对其中亚铁氧化活性较高的菌株YS-I进行了黄铁矿和闪锌矿浸出的比较试验。结果表明，这些细菌的大小为长约1.0-2.5um，直径0.4-0.6um，能运动，革兰氏染色显阴性，最适生长pH值为2.0，最适生长温度为30℃，能利用亚铁盐，单质硫和硫代硫酸钠，不能利用有机能源。YS-I浸矿数据表明该菌对铁闪锌矿和黄铁矿的浸出率分别为14.38%和3.8%。关键词：嗜酸氧化亚铁硫杆菌，菌种筛选，系统发育分析，浸矿试验中图分类号：：TF18文献标识码：A嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillusferrooxians）是典型喜温硫化矿浸矿细菌之一，化能自养，能氧化亚铁，单质硫及还原性硫化合物，杆状，细菌大小一般为长1.0～2.0um，宽0.5～0.6um，能通过极生鞭毛运动，细菌在生长过程中有时会出现链生现象[1]。最新的浸矿菌属分类将Acidithiobacillusferrooxians，Acidithiobacilluscaldus以及Acidithiobacillus.thiooxidans归类为原细菌中γ-proteobacteria[2,3]。浸矿功能菌种的定向选育对于提高实际矿样的浸出效果，具有重要的经济意义。成功的菌种定向选育与出发菌株的性能有直接的关系，而出发菌株的性能与菌株的来源地则密切相关。本实验意欲从典型矿区筛选浸矿功能菌株，为定向选育菌种提供基础菌株。为此，本实验从中国南方—广东梅州玉水生物提铜示范基地中酸性矿水中取回水样，从中筛选得到三株嗜酸硫杆菌，将其命名为YS-I，YS-II，YS-III。通过对其生理生化性质以及16SrDNA序列同源性分析，发现这三株菌均为嗜酸氧化亚铁硫杆菌；利用氧化活性相对较高的菌株YS-I对黄铁矿、铁闪锌矿进行了浸矿实验，取得了一定的浸矿效果。1.材料及方法1.1菌种来源实验中所采用嗜酸氧化亚铁硫杆菌均分离自广东梅州玉水生物提铜示范基地地下不同深度的矿坑中酸性矿水样品中，原始水样pH值介于2.5-5.0之间。1.2培养基富集培养基采用修饰的Waksman培养基(1L)：(NH4)2SO43.0g，Ca(NO3)20.01，KCl0.1g，MgSO4.7H2O0.5g，K2HPO40.5g，FeSO4.7H2O45g，加入1000ml蒸馏水，用1mol/LH2SO4调节pH到2.0。另外在实验过程中还采用了Waksman+单质硫（1%，W/V）作为培养基培养细菌。固体培养基采用修饰过的Starkey培养基(1L):A基本盐成份(NH4)2.SO43.0g，KCl0.1g，K2HPO40.1g，MgSO4.7H2O0.5g，Ca(NO3)20.01g，dH2O200ml；B成份琼脂粉15g，1本课题得到国家创新群体基金资助项目(50321402)和国家重大基础研究项目“973”(2004CB619204)的资助。；C成份FeSO4.7H2O22.2g，灭菌dH2O100ml。A、B分别121℃，0.1Mpa灭菌20min，FeSO4.7H2O采用0.22um超滤膜过滤除菌，A、B灭菌冷却混合后，再混合C，混合后的培养基用1mol/LH2SO4调节pH到2.5。本实验中如果没有特殊声明，所采用的液体培养基均为修饰过的Waksman培养基，培养条件均为250ml三角瓶中加100ml培养基30℃、175r/min恒温振荡器中培养；所选用固体培养基均是修饰过的Starkey培养基，涂布后的平板于恒温隔水式培养箱30℃培养。1.3采用试剂生化试剂：基因组提取试剂盒（EZ-10SpinColumnGenomicDNAMiniprepsKit）购自BioBasic公司，TaqDNA聚合酶购自Fermentas公司，凝胶提取试剂盒（E.Z.N.A®GelExtractionKit）购自OmegaBio-Tek公司，pBS-TPCR产物克隆试剂盒购自TIANGENBIOTECH公司（北京）。通用引物对63f(5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’)和1387r(5’-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3’)由北京三博远志生物技术有限公司提供。亚铁氧化滴定试剂：K2Cr2O70.02mol/L(使用时根据实验需求在稀释到相应浓度)，1:1硫磷酸（75mlH2SO4，75mlH3PO4，350mlH2O）,0.2%二苯胺磺酸钠[4]。实验采用矿物来源：本次实验中所选用的黄铁矿和铁闪锌矿由中南大学资源加工与生物工程学院矿物加工工程系提供。矿物基本成分如下：铁闪锌矿（Zn47.4%，Fe16.99%，S30.85%，）,黄铁矿（Fe44.79%，S47.74%）。1.4菌种分离及形态分析先用修饰过的Waksman液体培养基富集样品中的微生物，取10ml水样接到液体培养基中培养，待镜检可以看到明显的微生物时再用相同的培养基富集，富集三代后，采用平板连续分离3次，从平板上挑单菌落得到单菌株，将分离得到的三株细菌分别命名为YS-I，YS-II，YS-III。将分离的单菌株转到液体培养基中扩培后收获细菌，在光学显微镜（OlympusCX-31）下观察细菌的的形态和运动情况，经革兰氏染色后再观察其染色情况。细菌样品经处理后用扫描电镜(JEOLJSM-6360LV)观察细菌的显微结构。1.5生理生化性质测定1.5.1生长氧化曲线测定用液体培养基扩培好细菌后，离心分离富集细菌，将菌泥用灭菌的不含亚铁的Waksman培养基稀释，然后将稀释好的菌液接种到250ml含100ml修饰过的Waksman液体培养基中，保证接种初始浓度为1.0×106个/ml，每隔一段时间（4～8h）取一定量菌液，采用血小板计数法计量菌液中的菌数，同时采用亚铁氧化还原滴定法测定其中亚铁离子含量。1.5.2最适生长温度测定采用相同方法收集细菌后，同样用不含亚铁的Waksman培养基稀释，然后将稀释好的菌液接种到液体培养基中，保证每个接种后初始浓度均为1.0×106个/mL。将配好的菌液分别置于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃温度梯度中培养，2天后采用血小板计数法直接计数其中菌数。调节液体培养基的pH分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0。接种后保证每个样品中的细菌初始浓度均为1.0×106个/mL，在30℃条件下培养2天后采用血小板计数法测量其中菌的生长情况。1.6能源利用情况的测定在不含亚铁的基本液体培养基中（100ml）分别加入单质硫(1%)(W/V)，FeSO4.7H2O（4.31%）+单质硫（1%），硫代硫酸钠（1%），葡萄糖（1%），酵母粉（1%），蛋白胨（1%），黄铁矿（1%），铁闪锌矿（1%），其中硫代硫酸钠，FeSO4.7H2O均采用0.22um超滤膜过滤除菌后再加入培养基，硫磺隔水蒸煮一小时灭菌加入培养基，葡萄糖115℃灭菌20min后再加入培养基，30℃条件下培养5天后采用血小板计数法测量其中菌的生长情况。1.716SrDNA的PCR扩增，序列测定及系统发育树分析1.7.1染色体DNA的提取采用液体培养基培养细菌3天后，先用普通滤纸过滤尽量除去培养基中的铁矾，滤液先用4000r/min高速离心机离心5min最大限度除去培养液中沉淀后采用10000r/min离心10min富集细菌，然后用pH2.0硫酸清洗菌泥3次后转至1.5mlEP管中，用500ulTE(pH8.0)重悬细菌平衡pH后，按照基因组提取试剂盒内说明操作提取细菌的基因组DNA。1.7.216SrDNA的PCR扩增及序列测定采用通用引物63f(5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’)和1387r(5’-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3’)扩增细菌的16SrDNA，PCR扩增体系为：10×PCR缓冲溶液5µL,25mmol/LMgCl25µL,2mMdNTPmix5µL,引物63f（62.5µmol/L）和引物1387r（62.5µmol/L）各2µL，TaqDNA聚合酶（5u/µL）1µL,模板2µL。扩增程序为：945min℃；9445s℃，5545s℃，7290s℃，33个循环；7210min℃。PCR产物经过凝胶提取试剂盒（E.Z.N.A®）回收后，用pBS-TPCR产物克隆试剂盒将PCR产物转入大肠杆菌，然后挑阳性克隆子穿刺后送交北京三博远志公司测序。1.7.3系统发育树的构建将菌株的16SrDNA序列在GenBank核酸序列数据库中进行序列比对后，用ClustalX(1.8)软件进行16SrDNA同源性分析,并构建系统发育树。1.8浸矿试验浸矿实验采用了黄铁矿，铁闪锌矿，矿样的粒度为－200目,矿浆浓度为5%（W/V），100ml液体培养基中加入5g矿粉，细菌接种后浓度为1.0×107个/ml，培养十天后用原子吸收方法测量金属离子的浸出率。2.结果2.1细菌的形态特征分离纯化出来的三株细菌通过显微镜观察均为短杆状，能运动，革兰氏染色显阴性，扫描电镜分析表明三株细菌的大小介于长1.0-2.5um，直径0.4-0.6um如图1-C（YS-I在亚铁培养基中生长电镜照片，文中只列出了部分图片）。同时，通过扫描电镜比较了细菌Waksman+硫作培养基质的培养基和以Waksman+亚铁作为培养基培养细菌的差异性。在普通光学显微镜下观察就可以发现，在硫培养基里生长细菌明显比在亚铁培养基中瘦长，并且在含硫培养基里生长的细菌链生现象明显，如YS-II在含硫培养基中链生现象（见图1-D）。细菌在固体平板上培养一星期后开始出现白色凸起菌落，菌落直径约为0.2-1mm，表面光滑，边缘完整，如图1-A（YS-I）培养到十天左右，部分白色菌落开始变黄，菌落周围培养基也逐渐呈现黄色，培养到十四天左右，平板上菌落全部变成黄色，表面粗糙，菌落周围变得不规则，菌落中心呈现黄褐色。如图1-B（YS-I）。ABCDABCDABCD图1细菌在固体培养基上菌落形态以及菌株YS－I和YS－II分别在含亚铁和含硫培养基中生长情况。Figure1.ThecolonyofthestrainYS—IandthecellularstructureofthestrainYS—IandYS—II2.2生理生化特征2.2.1生长氧化曲线实验中三株细菌的生长曲线（如图2-A）迟缓期均介于8-10h左右，然后进入代数期，根据不同菌株的生长曲线数据可以计算细菌在代数生长期的比生长速率（µ）和代时（G）（数据见表1）。图2细菌的生长曲线2-A和亚铁氧化曲线2-BFigure2Thegrowthcurveofthethreestrainsandtheferrousionsoxidationratecurve中得知，同一个矿区不同的水样点筛选出来的细菌生长氧化活性大致相同，但还是有一些差异，其中YS-I的氧化活性高于