高效液相色谱原理(华东理工研究生课程课件)

第十三章高效液相色谱法第一节概述高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法一、HPLC与经典LC区别二、HPLC与GC差别三、特点一、HPLC与经典LC区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1．经典LC：仅做为一种分离手段柱内径1~3cm，固定相粒径100μm且不均匀常压输送流动相柱效低（H↑，n↓）分析周期长无法在线检测2．HPLC：分离和分析柱内径2~6mm，固定相粒径10μm（球形，匀浆装柱）高压输送流动相柱效高（H↓，n↑）分析时间大大缩短可以在线检测二、HPLC与GC差别相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测主要差别：分析对象的差别和流动相的差别1．分析对象GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测占有机物的20%HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的80%续前2．流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性3．操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）续前三、HPLC的特点和应用“三高”“一快”“一广”高柱效——n=104片/米，柱效高（远高于一般LC）高灵敏度高选择性分析速度快应用范围广泛（可分析80%有机化合物）第二节基本理论和条件选择热力学理论：塔板理论——平衡理论基础动力学理论：速率理论——Vander方程一、塔板理论二、速率理论三、HPLC法中分离条件的选择一、塔板理论理理nLH/22212)(16)(54.5)(WtWttnRRR理effeffnLH/221'2')(54.5)(16WtWtnRReff0'ttkR2)1(kknneff理二、速率理论（与GC对比）（填充柱）：uCuBAHGC/（毛细管柱）或uCuBH/dpA2dpAgmDDB22gRDBtB，MTDTDgg或llgsmCCCCCCllDdfC2TDL1.续前2）涡流扩散项及其影响nextuCAHHPLC：mDB2TDm相忽略大低，流动相柱温BTRtnHuuHscmu，但柱效，时，/1min/1mlu选择兼顾柱效和分析时间，2.讨论：1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）nextdpA2dpA柱效，，nHAdp续前3）传质阻抗项及其影响）（忽略固定相传质阻抗smmssmmCCCCCC忽略固定相传质阻抗态流动相的传质阻抗注：只考虑流动相和静uCuCAHHPLCsmm：msmmDdpCC2mDdpC2TDm柱效，nHCdp柱效，nHDm，柱阻，，但易产生气泡mmDTCDT三、HPLC法中分离条件的选择1.固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp≤10μm）首选化学键合相，匀浆法装柱2.流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相——甲醇，1ml/min3.柱温的选择：选室温250C左右第三节各类高效液相色谱法一、液固吸附色谱法（LSC）二、液液分配色谱法（LLC）三、化学键合相色谱法（BPC）一、液固吸附色谱法（LSC）流动相为液体，固定相为固体吸附剂1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异分离前提：K不等或k不等)1(0mRVSKttmVSKk续前2．固定相：与LC比，固定相粒径不同（10μm）（2）高分子多孔小球：YSG原理：吸附+分配蒹小孔凝胶作用特点：柱选择性好，峰形好，柱效低适用：分离弱极性化合物（1）硅胶表孔硅胶（薄壳硅胶）全多孔硅胶无定形YWG5~6μm5×104球形YQG3~4μm8×108堆积硅珠YQG3~4μm8×108理想原理：吸附特点：峰易拖尾适用：分离极性化合物续前3．流动相：底剂（烷烃）+有机极性调节剂例：正己烷或庚烷+氯仿---4．影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，tR↑溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，k↓，tR↓注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间5．出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱6．硅胶吸水量↑，LSC→LLC•硅胶含水量较小吸附色谱硅胶极性较大•硅胶含水量17%分配色谱硅胶失活→载体吸附的水→固定液二、液液分配色谱法（LLC）1．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异2．固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）缺点：系统内部压力大，易流失，不实用固定液——极性→NLLC固定液——非极性→RLLC3．正相色谱——固定液极性流动相极性（NLLC）极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱适于分离极性组分反相色谱——固定液极性流动相极性（RLLC）极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于分离非极性组分三、化学键合相色谱法（BPC）（一）化学键合相（二）反相键合相色谱（三）正相键合相色谱（四）离子对色谱和离子抑制色谱（一）化学键合相利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面1．分离机制：分配+吸附（以LLC为基础）2．特点：1）不易流失2）热稳定性好3）化学性能好4）载样量大5）适于梯度洗脱（二）反相键合相色谱1．分离机制：疏溶剂理论正相——流动相与溶质排斥力强，作用时间↑k↑，组分tR↑反相——流动相与溶质排斥力弱，作用时间↓，k↓，组分tR↓2．固定相：极性小的烷基键合相C8柱，C18柱（ODS柱——HPLC约80%问题）3．流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水流动相极性固定相极性底剂+有机调节剂（极性调节剂）例：水+甲醇，乙腈，THF续前4．流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑5．出柱顺序：极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱6．适用：非极性~中等极性组分（HPLC80%问题）（三）正相键合相色谱1．分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力2．固定相：极性大的氰基或氨基键合相3．流动相：极性小（同LSC）底剂+有机极性调节剂例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇续前4．流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓5．出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱极性大的组分后出柱6．适用：•氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）分离物质也相似•氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性分析极性大物质、糖类等（四）离子对色谱和离子抑制色谱1．反相离子对色谱法2．反相离子抑制色谱1．反相离子对色谱法（IPC或PIC）反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离1）离子对试剂：烷基磺酸钠→分析碱四丁基季胺盐→分析酸2）影响k的因素a．与m的极性有关（同反相色谱）b．与R的链长有关：R↑长，极性↓小，tR↑，k↑3）适用：较强的有机酸、碱2．反相离子抑制色谱在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制组分解离，增加其k和tR，以达到改善分离的目的1）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质pH一定的缓冲溶液2）k的影响因素：与流动相极性有关，还与pH值有关选择流动相：应同时考虑极性及pH值酸性物质——加入酸HActR↑，k↑碱性物质——加入碱NH3·H2OtR↑，k↑调节pH范围：3.0~8.0pH8.0破坏键合相与载体的结合pH3.0腐蚀柱子3）适用：极弱酸碱物质pH=3~7弱酸；pH=7~8弱碱；两性化合物第四节影响分离的因素1．22114kknRuCAH流动相采用粘度小、低流速的匀的固定相：采用粒度小、填充均n''''12121212RRRRVVttkkKK温影响小）质和固定相性质（受柱：调整流动相种类、性0'ttVVKVCVCWWkRmsmmssms小）的配比（受柱温影响较：调整流动相和固定相k续前2．对流动相的要求：1）与固定液不反应2）对样品有良好溶解度k=1~10k=2~5最理想的3）与检测器匹配：UV（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长）荧光，电化学4）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈）使用前过滤、脱气续前3．洗脱方式1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）类似GC的等温度洗脱2）梯度洗脱：在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例即不断改变其极性（两个泵）适于分析极性差别较大的复杂组分类似GC的程序升温（沸程较长样品）图示第五节高效液相色谱仪1．泵：恒压泵：流量精度不稳恒流泵：常用2．进样装置1）隔膜进样（高分子有机硅胶垫→进样室）GC系统压力较小，可以HPLC系统压力太大，必须停泵进样（早期）2）阀进样：不必停泵，六通阀续前3．色谱柱：直径4~6mm,柱长10~30cm柱效评价：色谱系统适应性试验R，n，fs（拖尾因子）柱再生：维护、保养、柱子的冲洗4．检测器1）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质2）荧光检测器：只能分析自身发光的物质灵敏度高3）示差折光检测器：利用折光率的差别灵敏度低，温度要求严格4）电化学检测器5）化学发光