第七章 酶的定向进化和稳定性探究

EnzymeEngineering酶工程第七章酶的定向进化与稳定性探究•第一节定向进化简介•第二节定向进化的应用•第三节蛋白质的稳定性•第四节蛋白质不可逆失活的原理和机理第一节定向进化简介•一．理论来源•二．概念•三．定向进化的选择策略•四．杂合酶一．理论来源•利用基因工程原理可以在实验室中模拟生物进化过程–化学进化–生物进化二．概念•酶分子改造–化学修饰，定点突变•定向进化定向进化示意图随机突变+定向选择＝目标突变体细菌诱发突变的因素500C培养突变体库选择压力（温度）温度耐受型突变体最适生长温度为370C最适生长温度提高了！Strategiesforthedevelopmentofeffectiveenzymes定向进化–属于蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。澄清一个事实：定向进化不是定点突变•定向进化：突变筛选突变位点是随机的，不确定的；突变位点的数目也是不确定的；突变的效应更是不可预知的；理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的，生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。•定点突变：突变位点是确定的，突变的个数也是预知的；突变的效应可能是已知的，也可能是未知的；定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。三．定向进化的选择策略–关键突变和筛选–突变——采用回交法–筛选蛋白酶选择平板初选，配合活性染色和X光片消化分析DNAshuffling体外定向进化Increasingtheee-valueofthelipase-catalyedhydrolysisofthechiralester2%31%57%75%81%0%01234mutantgenerations%ee成功实例Lipasegenes(lipB52,lipB68)isolatedfromPseudomonasfluorescensB52、B68GenbankAccssionnumberAY623009、AY694785成功实例Lipasegene(lipB52）expressedinPichiapastorisKM71ZhengbingJiang,Yitaozheng,YuLuo,GangWang,HongpingWang,YushuMaandDongzhiWei*.CloningandExpressionofaNovelLipaseGeneFromPseudomonasfluorescensB52.MolecularBiotechnology.2005(31),095-102.SDS-PAGEanalysisoflipaseonexpressionandpurification•functionallipasesecretedbyRecombinantsscreenedwithBMMYplatesEnantioselectiveesterificationofR-phenylethanol,S-phenylethnolremainedatitsoriginalformeep＞98.7%andconversion＞48.1%at40oCfor48hours.ModelChiralReactionCatalyzedbyLipaseB52Transesterificationbetweensoybeanoilandmethanol.Conversion＞90%at40oCfor35hoursProductionofBiodieselviaTransesterificationCatalyzedbyLipaseB52CharacterizationofapsychrophiliclipasefromPseudomonasfluorescensstrainB68•p-nitrophenylcaprateassubstrate.•Optimaltemperatureas20C，50%activityat0C。0%20%40%60%80%100%120%010203040506070Temperature(゜C)RelativeActivity(%)HydrolyzationactivityoflipaselipB68ChiralselectivityoflipB68ROHOOROHROO+lipaselipB68R=CH3,andCH2CH3ModelReaction：Chiralresolutionof-phenylethanoland-phenylpropanolviaesterification.Reactionsystemcontained:0.5mmolofracemic-phenylethanolor-phenylpropanoldissolvedin10mltoluenecontaining1mmolofvinylacetate,with0.5gimmobilizedenzymeadded.Samplestakenat120hourandsubjectedtoGCanalysis.ProductionofBiodieselviaTransesterificationCatalyzedbyLipaseB68•Yieldto92%at20Cand24hourswithimmobilizedlipB68.•Thelowesttemperaturereportedpreviously.ProductionofbiodieselfromsoybeanoilbyimmobilizedlipB68LipaseR&Dfromunculturedmicroorganism——Lipasegenes(lipJ02,lipJ03)isolatedfromenvironmentalsampleClonedwithGenome-Walking.GenbankAccssionnumberAY673674、AY700013LipaseR&Dfromunculturedmicroorganism——Lipasegenes(lipJ02,lipJ03)expressedinPichiapastorisKM71ZhengbingJiang,DongzhiWei*etal.,AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2006,OnlineFirst.FunctionallipasesecretedbyRecombinantsscreenedwithBMMYplatesSDS-PAGEanalysisoflipaseonexpressionandpurifiedProdrugsofibuprofenNHHNHClOOOOOMeOOONOHOHONHAcOHOHNOOHOHOOHOHOOOHOHOOHOOHOHNOROOOAcOAcOOAcOOAcOHOSynthesisofibuprofenglucopyransidederivativeOHOHOOOHOHOHOabOOHOHOOOHOOOHOHOOOHOH2OcdEnzymeSolvent(a)methylα-D-glucopyranoside,(b)ibuprofen,(c)6-O-(2'R-(4'-isobutylphenyl)propionyl)α-D-glucopyranoside(d)6-O-(2'S--(4'-isobutylphenyl)propionyl)α-D-glucopyranosideXiang-GuoZhao,Dong-ZhiWei*,AfacileenzymaticprocessforthepreparationofibuprofenesterprodruginorganicmediaJ.MolecularCatalysisB:Enzymatic,2005,36:47-53.DongzhiWei*,PingZou,J.MolecularCatalysisB:Enzymatic,2002,18:273-278.BiosynthesisofEthylglucosideLactateWeiDongzhi*,Yuying,BiocatalysisandBiotransformation,2003,21(3)135-139.EnzymaticSynthesisofEthyl-glucosideMonooleatewithLipaseinSolvent-freeMediumQingxunSong,DongzhiWei*,J.MolecularCatalysisB:Enzymatic,2002,18:261-266.Qing-XunSong,Dong-ZhiWei*,etal.,BiotechnologyLetters,2004,26(23):1777-1780.QingxunSong,DongzhiWei*,etal.,BioprocessandBiosystemsEngineering,2006,Onlinefirst.StudiesofVitaminestersynthesisbyimmobilizedlipasefromCandidasp.四．杂合酶•来自不同酶分子中的结构单元或是整个酶分子进行组合或交换，以产生具有所需性质的优化酶杂合体。第一节结束•点击返回第二节定向进化的应用•一．提高酶分子的催化活力•二．提高酶分子的稳定性•三．提高底物的专一性和增加对新底物．催化活力的进化•五．对映体选择性的定向进化•六．变换催化反应专一性一．提高酶分子的催化活力•L—天冬氨酸酶定向进化研究–进行4轮易错PCR，筛选了3000个菌落。–得到酶活力提高28倍的突变体，该酶的pH稳定性和热稳定性均优于天然酶二．提高酶分子的稳定性•T4溶菌酶11个不同的单点突变株将Tm提高0.8-1.4℃.•8株大肠杆菌核酸酶HI单点突变中，7株Tm提高了0.7-4.2℃三．提高底物的专一性和增加对新底物催化活力的进化•Gulick分离到了一株谷胱苷肽转硫酶，对于癌症治疗中烷化剂的耐受力提高了9倍•Widersten利用噬菌体呈现技术来增加谷胱苷肽转移酶与亲电底物结合力，没有成功四．对映体选择性的定向进化•S型选择性的转氨酶转化ß-丁酮，仅有65%的手性专一性。•通过10000个随机突变的菌株的筛选，获得10个手性专一性在80%-94%之间的酶五．变换催化反应专一性•来源于铜绿假单胞菌的脂肪酶对于底物p-硝基-苯基-2-甲基葵酸盐的S构型的选择性2%。•经过4轮易错PCR突变和筛选后，它对底物的S型的选择性达到81%第二节结束•点击返回第三节蛋白质的稳定性•蛋白质稳定性的分子原因•测定蛋白质稳定性的方法蛋白质稳定性的分子原因•金属离子、底物、辅因子和其他相对分子质量配体的结合作用•蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用•盐桥和氢键•二硫键图一图二•对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低•氨基酸残基的坚实装配•疏水相互作用•点击返回Disulfidebond•点击返回Disulfidebond•点击返回Proteinproteininteration•点击返回测定蛋白质稳定性的方法参数度量如何测定Tm熔化温度实验变性剂浓度50%变性所需的变性剂浓度实验ΔG(H2O)构象稳定性变性剂伸展曲线ΔG(25℃)构象稳定性热变性曲线Ts最大稳定性温度稳定性曲线相对活力/%时间t时保留的活力实验加速降解试验预测温度T时的寿命阿伦尼乌斯图第三节结束•点击返回第四节蛋白质不可逆失活的原理和机理第四节蛋白质不可逆失活的原理和机理1.蛋白水解酶和自溶作用2.聚合作用3.极端pH4.氧化作用5.表面活性剂和去污剂6.变性剂7.重金属离子和巯基试剂8.热9.机械力10.冷冻和脱水11.辐射作用proteasome•点击返回第四节结束•点击返回