第2章--反相层析

根据溶质的性质，采用极性的流根据溶质的性质，采用极性的流动相和非极性的固定相的分离体系动相和非极性的固定相的分离体系，利用固定相非极性基团的疏水效应而建立的一种分离模式。而建的种分离模式反相层析介质的表面通常比疏水层析介质更加疏水这导致更强的相互作用以至于为了成功的疏水。这导致更强的相互作用，以至于为了成功的洗脱，需要用非极性的有机溶剂比如乙腈或甲醇。疏水相互作用层析则提供了利用生物分子疏水性的另一种方法，即通过在更极性的，变性能力更弱的另种方法，即通过在更极性的，变性能力更弱的环境下工作。反相层析具有极高的分辨率，可以分离只具有微弱疏水性差异的组分。有微弱疏水性差异的组分。RPHPLCseparatesrabbitandhumaninsulinthatdifferbyRP-HPLCseparatesrabbitandhumaninsulinthatdifferbyonlyasingleaminoacid.Column:VYDAC®214TP54Column:VYDAC214TP54Eluent:27–30%acetonitrile(ACN)in0.1%TFAover25minutesat1.5mL/minute.反相‐高效液相色谱法柱和多肽之间的作用机理多肽与反相吸附剂之间互动的吸附/解吸吸模型的吸附/解吸吸模型多肽通过流动相进入反相柱相进入反相柱多肽被吸附到反相吸附剂的表面随着有机相浓度的改变并随着有机相浓度的改变并达到临界值时多肽从反相吸附剂表面解吸多肽通过流动相进入反相柱。多肽的疏水性部分（又称作疏水“脚”）被吸附到反相材料的疏水性表面，直到随着有机相浓度的改变并达到临界值时多肽才从反相吸附剂表面解吸附剂表面解吸相词常相衍生的常“反相”一词是从“常相”衍生出来的。常相层析是一种使用亲水固定相和含有己烷或氯甲烷相层析是种使用亲水固定相和含有己烷或氯甲烷等有机溶剂作为流动相的技术。在反相层析中，固定相是疏水的，所以使用了水/有机溶剂作为流动相使用就是说固定相比流动相更加疏水反相相使用，就是说，固定相比流动相更加疏水。反相层析填料作为吸附体而洗脱溶液作为流动相。REVERSEDPHASE：NORMALPHASE：载体：球形微粒多孔硅胶、特殊的高分子合成材料。特点：机械强度高；具有较多的可用于活化的羟基；微孔结构容易控制。配基：烷基化合物如C4、C8、C12、C18等。配基：烷基化合物，如C4、C8、C12、C18等。碳链越长，疏水性越大，稳定性越好。碳链长所占空间体积较大介质表面可使用的碳链长，所占空间体积较大，介质表面可使用的有效孔径变小，柱效下降。生物大分子：C4、C8的烷基；C8的烷基；多肽C18烷基多肽：C18烷基Peptideseparationondifferentreversed-phasecolumnsColumns:VYDAC®218TP54(C18);214TP54(C4);219TP54()(phenyl);Eluent:15–30%ACNin0.1%aqueousTFAover30minutesat1.0mL/min.Sample:1.oxytocin,2.bradykinin,3.angiotensinII,4.neurotensin,5.angiotensinI.辛基－硅胶介质的合成辛基硅胶介质的合成4.5g正辛基40g四氯化碳二甲基氯硅烷40g四氯化碳密闭容器混匀，超声波脱气100mg硅胶载体g超声波脱气超声波脱气30min室温下反应24h过滤后分别用四氯化碳、丙酮溶剂洗涤，过夜即可。常用反相柱的规格：30mm×21mm常用反相柱的规格：30mm×2.1mm100mm×2.1mm50×150mm×1mm介质颗粒度：5-7μm，孔径30nm流动相多采用酸性的、低离子强度的水溶液。由于生物大分子的疏水部分相差较大，流动相由于生物大分子的疏水部分相差较大，流动相只用一种水溶液不能满足多分离组分的要求，在水溶液中加入一定比例的与之相混的有机溶剂对其溶液中加入定比例的与之相混的有机溶剂，对其极性进行调整。•常用的有机溶剂：甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、丙酮、氢呋喃等四氢呋喃等。•乙腈的毒性是甲醇的5倍，是乙醇的25倍。常用流动相：01％三氟乙酸－乙腈（TFA－ACN）常用流动相：0.1％三氟乙酸乙腈（TFAACN）系统。TFA特点紫外吸收少TFA特点：紫外吸收少可挥发，易除去可靠性缺点：在190-250nm波长下易造成基线漂移。可以通过调整溶剂A与溶剂B中TFA的量来•可以通过调整溶剂A与溶剂B中TFA的量来消除。使用新鲜配制的TFA不宜在储液瓶中长•使用新鲜配制的TFA，不宜在储液瓶中长时间放置。SignificantdifferencesinthepeptideinthepeptideseparationpatternduetodifferencesinTFAconcentrationareevident.Column:C18(VYDAC®218TP54)Fl(VYDAC®218TP54).Flowrate:1mL/min.Eluent:Gradientfrom0–50%Gradientfrom050%ACNinaqueousTFA,concentrationasindicated.Sample:TrypticdigestofapotransferrinNote:apotransferrin.Note:Onlypartofthechromatogramisshown.•pH•离子对试剂有机修饰剂•有机修饰剂ElutionoffivepeptidesatpH2.0,4.4and6.5withhhtthbffphosphateasthebuffer.Column:VYDAC®218TP54(C18,5μm,4.6x250mm).Eluent:15–30%ACNin30minat1.0mL/min;plusA.20mMphosphate,pH2.0B20mMphosphatepH44C20mMphosphatepH65B.20mMphosphate,pH4.4C.20mMphosphate,pH6.5Peptides:1.bradykinin2.oxytocin3.angiotensinII4.neurotensin5.angiotensinI.增加带电组分的疏水性提高其与填料的结增加带电组分的疏水性，提高其与填料的结合，并因此改变滞留时间的通常方法是向洗脱液中添加离子对试剂。这些试剂通过离子相互作用中添加离子对试剂。这些试剂通过离子相互作用和带电基团结合，因此抑制它们对整体疏水性的影响。由于大多数蛋白和肽具有轻微的碱性，离，子对试剂通常是酸，比如三氟乙酸（TFA），三乙胺之类的碱则用于带负电的分子。始洗脱时向洗脱液中有修饰剂开始洗脱时，需向洗脱液中添加有机修饰剂来增强洗脱力量。增强洗脱力量。有机修饰剂必须可以和水互溶，不具有紫外吸光，以便检测正在洗脱的分子。沸点必须足够低以便洗脱后的挥发便洗脱后的挥发。层析步骤平衡↓上样上样↓平衡除杂平衡除杂↓↓洗脱•梯度洗脱：分离纯化常用梯度通常是由相对亲水的条件（高水含量梯度通常是由相对亲水的条件（高水含量，低有机修饰剂含量）向疏水条件（低水含量，高有机溶剂含量）进行机溶剂含量）进行。•阶段洗脱：脱盐阶段洗脱：脱盐At39%ACN,theretentiontimeoflysozymeisnearly18minutes.IncreasingtheACNconcentrationto40%reducestheretentiontimebymorethanhalf,to7.6iIihACNi42%minutes.IncreasingtheACNconcentrationto42%reducestheretentiontimeoflysozymeagainbymorethanhalf,to3.1mintues.Column:VYDAC®214TP54Eluent:ACN3940d42%i01%TFAACNat39,40and42%in0.1%aqueousTFA.Column:C18,4.6×150mm.Flowrate:1mL/min.Eluent:Gradientfrom060%ACNi0–60%ACNinaqueous.1%TFAin60min.Temperature:Asindicated.SlTiSample:Trypticdigestofhumangrowthhormonegrowthhormone.RPLCRPLC应用应用蛋白肽核苷酸和有机小分子等的高分辨RPLCRPLC应用应用蛋白、肽、核苷酸和有机小分子等的高分辨分离和分析分离和分析。肽谱。肽谱。纯度检查。纯度检查。脱盐与浓缩。蛋白质顺序指肽链中氨基酸的排列顺序通常从左至右表示肽链从氨基酸氨基端（N末端）通常从左至右表示肽链从氨基酸氨基端（N末端）到羧基端（C末端）蛋白质测序仪工作原理：执行全自动化的Edman化学降解反应和游离氨基酸的分离与鉴定过程。PTHAASTDPTH-AASTDR1R2R2测序结果：SAG测序结果：SAGR3R3相同点：相同点：◦层析原理相同，都基于溶质、极性流动相和非极性固定相表面的疏水效应而建立的层析模式。◦配基都是不同长度的烷烃或芳香类化合物。不同点：不同点：◦配基密度：HIC比RPC要低10-100倍◦层析介质表面的疏水性：RPCHIC◦流动相◦流动相RPC多采用酸性、低离子强度的水溶液，并加入一定比例有机修饰剂。HIC分离时，流动相一般为中盐水溶液常有剂中性盐水溶液，pH6-8，通常不需有机添加剂。◦对蛋白质三级结构的影响RPC过强的疏水性和过多的有机溶剂会导致蛋白RPC过强的疏水性和过多的有机溶剂会导致蛋白质的不可逆吸附及其三级结构的不可逆变性。HIC则基本不破坏蛋白质的三级结构。HIC对疏水性很强的蛋白质保留较强，但对亲水性蛋白质保留都十分弱分离疏水性相差较亲水性蛋白质保留都十分弱。分离疏水性相差较大的蛋白质混合物，如细胞色素c和溶菌酶，用C会得到比C好得多的效果HIC会得到比RPC好得多的效果。通常在HIC分离纯化酶的过程中，失活最大不超过10%左右；而RPC分离，酶活性一般会损失20%以上甚至50%。所以活性蛋白质用HIC失20%以上，甚至50%。所以活性蛋白质用HIC分离纯化较为理想。