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成都医学院-生化与分子生物实验实验十限制性酶切与连接成都医学院-生化与分子生物实验一种能够结合外源DNA片段形成重组DNA,并能进行自我复制的DNA分子称为Vectors.主要载体:质粒、噬菌体、病毒按功能分类:克隆载体(构建基因组文库或cDNA文库)、测序载体、表达载体以及能在两个不同物种中存在的穿梭质粒。随着生物技术的发展和科学研究的深入,不断出现具有不同功能的新载体,如可以容纳几百万碱基的酵母人工染色体。载体(Vectors)结构的三大要素:•多克隆位点•选择标记(耐药性,LacZ)•独立的复制单位由pUC18改造而来,大小为3162bp。相当于在pUC18中增加了带有M13噬菌体DNA合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。(二)材料模板DNA引物:APOA1-GST2(载体:pGEX-6P-1)PrimerGST6p1-APOA1-Up:5’GGAATTCATGGATGAACCCCCCCAGAGCC-3’EcoRIPrimerGST6p1-APOA1-down:5’CGCGTCGACTCACTGGGTGTTGAGCTTCT-3’SalI粘性末端:是交错切割,结果形成两条单链末端,这种末端的核苷酸顺序是互补的,可形成氢键,所以称为粘性末端。如EcoRI的识别顺序为:5’……G|AATTC……3’3’……CTTAA|G……5’在双链上交错切割的位置切割后生成5’……GAATTC……3’3’……CTTAAG……5’各有一个单链末端,二条单链是互补的,其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。成都医学院-生化与分子生物实验成都医学院-生化与分子生物实验一、DNA的限制性酶切实验原理核酸限制性内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶,这些酶都是从原核生物中发现,功能犹似高等功物免疫系统,用于抗击外来DNA侵袭。限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键,产生的DNA片段5’端为P,3’端为OH。成都医学院-生化与分子生物实验根据限制酶的识别切割特性,催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。第一类(I型)限制性内切酶能识别专一核苷酸顺序,在识别位点很远的地方任意切割DNA链,切割核苷酸顺序没有专一性,随机。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大,无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。第三类(III型)限制性内切酶也有专一的识别顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此,这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段,具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。1.限制性内切酶的类型成都医学院-生化与分子生物实验第二类(Ⅱ型)限制性内切酶就是通常指的DNA限制性内切酶.它们能识别双链DNA的特异顺序,并在这个顺序内进行切割,产生特异的DNA片段;Ⅱ型酶分子量较小,仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子,识别顺序一般为4~6个碱基对的反转重复顺序;Ⅱ型内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口--5’端突出、3’端突出和平末端。限制性的内切酶的发现和应用,才使得人们能在体外有目的地对遗传物质DNA进行改造,从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。1.限制性内切酶的类型成都医学院-生化与分子生物实验限制性内切酶酶分子识别位点切割位点限制作用是否需用ATPⅠ类三亚基双功能酶二分非对称至少在识别位点外1000bpYesⅡ类内切酶与甲基化酶分子不在一起4-6bp,大多数为回文对称结构在识别位点中或靠近识别位点无特异性NoⅢ类二亚基双功能酶5-7bp非对称在识别位点下游24-26bpYes成都医学院-生化与分子生物实验Ⅱ型内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口--5’端突出、3’端突出和平末端。限制性的内切酶的发现和应用,才使得人们能在体外有目的地对遗传物质DNA进行改造,从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。成都医学院-生化与分子生物实验粘性末端:是交错切割,结果形成两条单链末端,这种末端的核苷酸顺序是互补的,可形成氢键,所以称为粘性末端。如EcoRI的识别顺序为:5’……G|AATTC……3’3’……CTTAA|G……5’在双链上交错切割的位置切割后生成5’……GAATTC……3’3’……CTTAAG……5’各有一个单链末端,二条单链是互补的,其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。成都医学院-生化与分子生物实验II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链,产生平头末端。例如EcoRV的识别位置是:5’……GAT|ATC……3’3’……CTA|TAG……5’切割后形成5’……GATATC……3’3’……CTATAG……5’这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。平头末端:成都医学院-生化与分子生物实验用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称,如E.coli用Eco表示,所以用斜体字。用一个字母代表菌株或型,如流感嗜血菌(Heamophilusinfluenzae)Rd菌株用d,即Hind。如果一种特殊的寄主菌株,具有几个不同的限制与修饰酶,则以罗马数字表示,如HindⅠ,HindⅡ,HindⅢ等。2.限制性核酸内切酶的命名法成都医学院-生化与分子生物实验1.内切酶:不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染;注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端;内切酶的用量:根据内切酶单位和DNA用量而定,通常1u指在适当条件下,1小时内完全酶解1ug特定DNA底物所需要的限制性内切酶量,使用中一般以1ugDNA对2-3u酶短时间为宜。同时内切酶体积不能超过反应体系10%,因内切酶中含50%甘油,体系中甘油超过5%会抑制内切酶活力;内切酶操作应在低温下进行(冰上);使用时防止操作中对内切酶的污染。注意事项——限制性内切酶酶切成都医学院-生化与分子生物实验作为内切酶底物,DNA应该具备一定的纯度,其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等,这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。这种抑制可通过:增加酶作用单位数(10~20U/ugDNA)、增大反应体积以稀释可能的抑制剂或延长反应时间加以克服。五、注意事项——限制性内切酶酶切2.DNA:成都医学院-生化与分子生物实验反应缓冲液主要由Tris·HCl、NaCl、Mg2+组成,其中Mg2+为内切酶辅基;Tris·HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间;NaCl浓度不同形成3种级别的离子强度:低盐(10mMNaCl)中盐(50mMNaCl)高盐(100mMNaCl)不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。五、注意事项——限制性内切酶酶切3.反应缓冲液:成都医学院-生化与分子生物实验连接反应---连接酶(ligase)ligase又称合成酶,能催化两个分子连接成一个分子或把一个分子的首尾相连接的酶。此反应与ATP的分解反应相偶联。在把两分子相连接的同时发生三磷酸腺苷(ATP)的高能磷酸键的断裂如DNA连接酶等连接酶的催化反应过程需要Mg离子成都医学院-生化与分子生物实验T4DNA连接酶催化双链DNA相邻核苷酸的5´-磷酸和3´-羟基之间的连接,平端和粘端都可被连接。本酶也能催化RNA连接到DNA或者双链RNA上,但不催化单链核酸的连接。把一个片段克隆到质粒载体时,采用1:1,1:3或3:1的载体:插入片段摩尔比连接反应---T4连接酶反应体系:载体DNA100ng插入片段DNA17ng连接酶10X缓冲液1μlT4DNA连接酶(Weiss单位)0.1–1u无核酸酶水加至10ul2.孵育反应于:室温下3小时,或4°C过夜,或15°C,4–18小时。实验步骤与试剂(酶切)反应体系1.质粒pUC18DNA2μl2.PCR产物2μl3.HindⅢ内切酶2μl4.HindⅢ10Xbuffer2μl5.ddH2O12μl总体系为20μl,混匀反应步骤1.37°C酶切2h2.65°C灭活10min3.琼脂糖电泳检测1.内切酶失活2.DNA不纯,含有SDS,酚,EDTA等内切酶抑制因子3.条件不适(试剂、温度)4.DNA酶切位点上的碱基被甲基化5.DNA酶切位点上没有甲基化(如DpnI)6.DNA位点上存在其它修饰7.DNA不存在该酶识别顺序1.标准底物检测酶活性2.将DNA过柱纯化,乙醇沉淀DNA3.检查反应系统是否最佳4.换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解,重新将质粒DNA转化至dcm-,dam-基因型的细菌菌株5.换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA(如San3AI代替DpnI),重新将质粒转至dcm+dam+菌株中扩增6.将DNA底物与λDAN混匀进行切割验证7.换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证限制性内切酶酶切常见问题分析问题一:DNA完全没有被内切酶切割原因对策1.内切酶活性下降2.内切酶稀释不正确3.DNA不纯,反应条件不佳4.内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰5.部分DNA溶液粘在管壁上6.内切酶溶液粘度大,取样不准7.酶切后DNA粘末端退火8.由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性9.过度稀释使酶活性降低10.反应条件不适11.识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序1.用5-10倍量过量消化2.用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶3.同上4.同上5.反应前离心数秒6.将内切酶稀释,增大取样体积7.电泳前将样品置65℃保温5-10分钟,取出后置冰浴骤冷8.使用标准反应缓冲液及温度,避免强烈振荡9.适当稀释酶液,反应液稀释的酶不能贮藏10.使用最佳反应体系11.加大酶量5-10倍问题二:DNA切割不完全原因对策限制性内切酶酶切常见问题分析1.内切酶星状活性2.其它内切酶污染3.底物中含其它DNA杂质1.检查反应条件:甘油浓度大于12%,盐度过低,Mn2+的存在及酶:DNA值过大均均可导致星状活性,降低酶的用量2.用λDNA作底物检查酶切结果3.电泳检查DNA,换用其它酶切,纯化DNA片段问题三:DNA片段数目多于理论值原因对策限制性内切酶酶切常见问题分析1.DNA定量错误(如RNA含量较高)2.在酶切反应液中形成非特异的沉淀1.用RNA酶A(无DNA酶)100ug/ml消化DNA样,酚抽提后沉淀溶解,定量2.在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次问题四:酶切后没有观察到DNA片段的存在原因对策限制性内切酶酶切常见问题分析1.保存温度不合适2.以稀释形式保存3.贮藏缓冲液不适当4.低蛋白浓度1.内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中,应在-20℃低温保存2.稀释酶液不宜长期存放,应一次使用3.使用厂家推荐的贮藏缓冲液4.内切酶与500ug/ml的BSA一起保存问题五:内切酶保存期内快速失活原因对策限制性内切酶酶切常见问题分析1.DNA上结合有蛋白质2.内切酶中含有DNA外切酶1.减少酶用量或消化时间,换用新包装的酶2.减少酶用量或消化时间,换用新包装的酶问题六:电泳后DNA片段的带型弥散,不均一原因对策DNA电泳常见问题分析1.含磷酸盐的浓度高2.内切酶失活不全或含有ATP酶3.平末端连接4.外切酶污染5.连接缓冲液不合适1.透析,乙醇沉淀去除磷酸盐2.延长灭活时间或用酚抽提,乙醇沉淀回收DNA3.加大T4DNALigase用量4.减少酶用量,缩短保温时间,酚抽提回收DNA5.重新配制连接缓冲液DNA电泳常见问题分析问题七:酶切后的DNA片段连接效率低原因对策1.DNA降解2.电泳缓冲液陈旧3.所用电泳条件不合适4.DNA上样量过多5.DNA样含盐过高6.有蛋白污染7.DNA变性1.避免核酸酶污染2.电泳缓冲液多次使用后,离子强度降低,pH值上升,缓冲能力减弱,从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液3.电泳时电压不应超过20V/cm,温度<30℃;巨大DNA链电泳,温度应<15℃;核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力4.减少凝胶中DNA上样量5.电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐6.
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