实验1大肠杆菌的培养和分离

实验1：大肠杆菌的培养和分离微生物包括哪五类：病毒细菌放线菌真菌原生生物特点：结构简单,形体微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.原核生物界原生生物界真菌界病毒界一、基础知识：(一)微生物大肠杆菌（E.coli）分布：人和哺乳动物肠道，此外还广泛分布于水、污水、土壤、谷类、乳制品等当中。大肠杆菌在人体的_____中一般对人体无害，但任何大肠杆菌如果进入__________都会对人体产生危害。大肠杆菌是_______工程中被广泛采用的工具。肠道泌尿系统基因革兰氏______（填阴或阳）性菌阴代谢类型：异养，兼性厌氧型生长适宜温度：质粒、EcoRⅠ限制酶、E.coli-DNA连接酶、受体细胞37℃左右大肠杆菌酵母菌放线菌霉菌菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量生长繁殖时，所形成的肉眼可见的具有一定形态结构的子细胞群体。不同微生物形成的菌落具有不同的特征，是鉴定菌种的重要依据。如菌落的大小、形状、边缘、光泽度、颜色、透明度等。菌落的概念白色或乳白色，光滑大肠杆菌菌落：有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.一、基础知识：（二）培养基培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。（1）按物理状态分：固体培养基和液体培养基、半固体培养基。（2）按功能分：选择培养基和鉴别培养基。（3）按成分分：天然培养基和合成培养基。1.培养基的类型和用途液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长固体培养基：菌落，菌苔半固体培养基：无动力有动力(弥散)(是否运动)选择培养基加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基:分离导入了目的基因的受体细胞加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基:分离杂交瘤细胞天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染;根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定;成本低缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。合成培养基:天然培养基：血清中含有：①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）②多种金属离子；③激素；④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。⑤各种生长因子⑥转移蛋白⑦不明成分人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。培养基的用途液体培养基：增菌，常用于发酵工业固体培养基：增菌，菌种保存及分离纯化、鉴定菌落、活菌计数等半固体培养基：动力检测，保种不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方调节pH2、成分水、碳源、氮源、无机盐、生长因子(生长因子即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)真菌：5～6细菌：6.5～7.5有时会加一定量的氯化钠以维持一定的渗透压1.无菌操作的概念无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止________污染的方法。四、无菌操作_________必须无菌、_________也必须要无菌、___________时不能带入其他杂菌主要包括：杂菌2.消毒与灭菌的概念及两者的区别消毒：使用较温和理化因素，仅杀死物体表面或内部的一部分对人体有害的微生物的过程。不能杀死芽孢和孢子。灭菌：使用强烈的理化因素消灭物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。各种器具培养基转移菌种比较消毒与灭菌比较项理化因素的作用强度消灭微生物的数量芽孢和孢子能否被消灭消毒灭菌较为温和部分生活状态的微生物不能全部微生物强烈高压蒸汽灭菌（湿热灭菌）洒精灯灼烧灭菌干热灭菌（1）灭菌方法：3、常用的灭菌和消毒的方法培养基、无菌水、各种耐高温的玻璃金属器具100kPa、121℃下维持15-30min需要保持干燥耐高温的玻璃金属器皿160-170℃下加热1-2h接种环等金属器具1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源4、紫外线消毒……(2)消毒的方法：3.常用的消毒与灭菌的方法请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。（一）制备LB培养基（通用的细菌培养基）1、配方：蛋白胨0.5克，酵母提取物0.25克，氯化钠0.5克，水50ml（配固体培养基再加琼脂1克）溶解计算称量调pH分装加塞，包扎2、流程二操作步骤灭菌倒平板①分装：注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，因此在将培养基转移到三角瓶或试管中时必须用__________。②加塞：试管用塑料盖或________；三角瓶口用_______或_________封口,再用_________或报纸封口。③包扎：用________或报纸三角漏斗棉花塞封口膜6层纱布牛皮纸牛皮纸高压蒸气灭菌法④灭菌1）加水：2）装锅：向外层锅内加入适量的水，加水的要求是_________.物品放置的要求______________________：加盖：将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的_______内。再以________方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。不触及内胆整齐、稳定、留出空隙排气槽两两对称3）加热排气：4）保温保压：5）出锅：打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的_______。_________________后，关上排气阀。当锅内压力升到_______kg/cm2时，控制热源，维持压力至______min。切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力降至____时，打开________，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。冷空气待冷空气完全排尽0115排气阀否则会因锅内压力较高，打开气阀后造成的压力差可能使容器内的培养基喷溅造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至使容器爆炸。灭菌后，通常将实验用具放入60℃~80℃_____中烘干，以除去灭菌时的水分，避免引起_____。烘箱污染倒平板：待培养基冷却至_____℃时，将每只培养皿倒入_________ml未凝固的固体培养基，置于_____位置上，轻轻晃动使其均匀铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。_______备用。制斜面：将未凝固的固体培养基的试管____放，冷却待凝使即成为斜面。６０10～12水平倒置斜⑤倒平板、制斜面操作平台：灭菌好的培养基和实验器具置于超净台上打开_________和___________，灭菌30min.过滤风紫外线超净台思考题：A、操作过程中避免带入杂菌的方法有哪些？1、灭菌后的培养基、器具置于超净台上，并打开超净台的紫外灯和过滤风，灭菌30分钟。2、用镊子夹出洒精棉球擦拭桌面和实验者双手。3、整个操作在酒精灯火焰旁进行4、打开后或加塞前试管口、三角瓶口灼烧灭菌。B、培养基灭菌后，需要冷却到60后才倒平板，你用什么办法来估计培养基的温度呢？可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。思考题C、为何要将平板倒置？平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落培养基，造成污染。D、在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。E、如何检查培养基是否受杂菌的污染？将未接种的培养基放在恒温箱中培养，若无菌落产生则未受杂菌污染。（二）液体培养基接种培养主要器具：操作方法：先将接种环进行_____灭菌,______后的接种环挑取少量菌种，放入三角瓶的液体培养基中，加塞。置于____℃摇床振荡培养１２小时。无菌操作：略摇床思考：如何冷却接种环？可通过接触试管内壁或未长菌的培养基达到冷却的目的。接种环、摇床等３７灼烧冷却（三）平板划线分离法主要器具：操作过程：注意：无菌操作方法：同前。将培养皿______（盖在下），放于_____℃恒温培养箱中培养__________小时。在作第二次以及其后的划线操作时，要从上一次划线的开始________划线。接种环、思考：若如上图所示进行划线分离，则接种环总共进行几次灼烧灭菌？恒温培养箱。每次划线前接种环都要灼烧灭菌，再冷却。末端１２～２４倒置３７平板划线的操作方法交叉划线法连续划线法1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。2、在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？划线结束后灼烧接种环，及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。3.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。4.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。5、如何判断接种操作是否符合无菌要求？如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求。（四）稀释涂布平板法主要器具：玻璃三角刮刀、移液管或吸管操作过程：先将培养菌液稀释（10-5~10-7倍）用移液管或吸管取0.1ml稀释度不同的菌液，加在平板上，用无菌玻璃三角刮刀均匀涂布在培养基平面上。在适当稀释度下，可培养得到相互分开的的菌落。将培养皿倒置（盖在下），放于３７℃恒温培养箱中培养１２～２４小时。划线分离方法简单；涂布分离，易形成单菌落，但操作复杂些。10g土样从土壤中分离微生物稀释涂布法（五）斜面接种及菌种保存主要器具：操作过程：在无菌操作下，用接种环挑取___菌落，再用划线法（自斜面底部向上轻轻划直线）接种在_____上，_____℃恒温培养箱中培养____小时后，____℃冰箱保存。无菌操作：同前试管斜面培养基密闭效果比平面的好很多,不容易进入杂菌，同时能用来做纯细菌的长期保存。思考：菌种保存为何采用斜面而不是平板？接种环、恒温箱、冰箱单斜面３７２４４菌种的保存1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。2、长期保存：甘油冷冻管藏法实验一大肠杆菌的培养和分离实验步骤：一配制LB培养基溶解计算称量调pH分装加塞，包扎灭菌二倒平板、制斜面三大肠杆菌的培养三大肠杆菌的分离平板划线分离法（或稀释涂布平板法）使所需细菌大量繁殖获得单菌落，纯化菌株四斜面接种培养目的菌株的纯培养和菌种保存类型一培养基及无菌技术【典例1】(2015·绍兴模拟)请回答下列与大肠杆菌有关的问题。(1)从生态系统的成分上看，大肠杆菌属于。成分含量蛋白胨10.0g乳糖5.0g蔗糖5.0gK2HPO42.0g显色剂0.2g琼脂12.0g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL(2)下表是某公司研发的一种培养大肠杆菌