第六章色层分离法

Pleasebequiet,上课了！！第六章色层分离法化学分离法色层法的发现色谱法的诞生M.C.Tswett进行了分离植物叶中各种色素的实验。创立了色谱法。碳酸钙（固定相）色素混合液石油醚(流动相）Tsweet发现色层分离现象色谱柱色带植物色素分离图示色层分离定义色层分离过程中，一种流动相（石油醚）带着被分离的物质（叶绿素）流经固定相（碳酸钙），使欲分离物质中的各种组分分离。色层分离（色谱分离，层析分离，分析检测中又称色谱分析）利用混合物中各组分物理化学性质的差异使各组分在两相中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。吸附力分子形状及大小分子亲和力分配系数色层分离的基本原理性质固定相流动相固定不动的物质称作固定相(固体或液体)推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体色层系统组成色层分离的特点分离效率高：是所有分离纯化技术中最高的；尤其适合极复杂混合物的分离。应用范围广：从极性到非极性、离子型到非离子型、小分子到大分子、无机到有机及生物活性物质、热稳定到热不稳定化合物，尤其对生物大分子样品的分离是其它方法无法代替的。色层分离分类根据流动相性质不同分类气相色谱（GC）仅限于能够气化的物质，且主要用于分析。气相色谱包括气液色谱GLC、气固色谱GSC。液相色谱（LPC）可分为液液色谱LLC、液固色谱LSC。进样阀流动相检测器高压泵脱气装置安捷伦推出《原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法》层析分离分类按固定相所处状态不同分类：①柱层析：②纸层析：③薄层层析：层析分离分类按溶质分子与固定相相互作用机理①吸附层析（范德华力，氢键，静电力，共价力）②分配层析（溶质在两液相间分配系数不同）③离子交换层析④凝胶过滤（分子大小与形状）纸层析小实验当滤纸接触到溶剂时，溶液将上升。滤纸上的小圆点是4种不同的氨基酸的混合物。看看接下来会发生什么事情…可以看出1号氨基酸上升的最高，在滤纸上跑得最快。而4号氨基酸与滤纸的结合最紧，因此跑的速度比其他的氨基酸慢。1234这就是纸层析法。纸层析法是分离鉴定蛋白质的氨基酸组成的重要工具。1234甘氨酸半胱氨酸组氨酸缬氨酸纸层析小实验动画演示纸层析原理纸上层析是利用混和物中各组分在固定相和流动相中的溶解度不同而达到分离目的。在纸色谱分离过程中，由于滤纸纤维素的毛细管现象，使得溶剂在纸上渗透展开。毛细管现象将毛细管插入液面后，会发生液面沿毛细管上升(或下降)的现象，称为毛细管现象。(a)液体在毛细管中上升h(b)液体在毛细管中下降h纸层析操作纸层析法操作步骤样品处理点样定性平衡展层显色1.样品处理试样的溶解固体样一般用乙醇、丙酮、氯仿等，尽量避免用水。液体样直接点样。2.点样a先用铅笔在距纸条一端2～3cm处划一条直线（起始线）并在线上隔一定距离划一“x”号表示点样位置；见下示意图：b.点样工具：定性分析可用普通毛细管，定量分析需用微量注射器；每次点样的位置应完全重合，否则会出现斑点畸形现象。c.点样方法：用点样工具吸取试液轻轻与“x”号接触，使点样的斑点直径为0.2～0.5cm,每次点样后，以冷风吹干；d.干后，将纸的两边用线缝好，以圆筒形式置于层析缸中展开。3.平衡展开以前先将滤纸与层析缸用配好的溶液系统的蒸汽来饱和，这个过程称之为“平衡”。用于减少边缘效应和提高分辨率。平衡一般在密闭的层析缸内进行。4.展层平衡结束后，将滤纸靠样品点的一端浸入溶剂中，展开开始：溶剂液面距原线距离约1cm，展开结束：当溶剂前沿到达滤纸另一端0.5-1cm处时，取出滤纸，在溶剂前沿处做一标记，晾干或用冷风吹干。按溶剂在滤纸上流动的方向不同，展开有上行、下行和环行三种方式。（1）上行法将滤纸点样的一端向下浸入溶剂中优点：操作简单，重现性好，是最常用的展开方法，缺点：展开时间较长。(2)下行法：在层析缸上部有一盛展开剂的液槽，将滤纸点样的一端朝上浸入槽中优点：展开速度快缺点：重现性较差，斑点易扩散。玻片玻璃棒原点玻皿剪成锯齿状，便于溶剂滴下5.显色a有色物：直接观察各个色斑b无色物：物理法显色：用紫外灯照化学法显色：利用各种物质的特性反应，喷洒适当的显色剂。红蓝墨水层析化学分离法计算Rf测=？abRf＝原点到溶剂前沿的距离原点到层析斑点中心的距离比移值Rf6.定性分析aa+bb各种化合物的值Rf随结构、滤纸的种类、展开剂、温度等的不同而异。但上述条件固定的情况下，对于某一化合物来说，Rf值是一个常数。故Rf值可作为定性鉴定的依据。7.定量分析对被分离的物质进行定量的方法很多，常用的有：(1)剪洗比色法：(2)直接比色法：(3)面积测量法：实验注意事项（1）不要倾斜层析瓶，不要让层析液沾到容器内壁上；（2）滤纸插入层析瓶中要挺直；（3）不能使点好的混合物碰到层析液（4）点层析试样时，直径0.3-0.5cm的斑点边缘效应托尾现象展开剂选择不当流动相比例点样量展开剂蒸汽饱和程度纸层析详细操作步骤将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中取层析滤纸一张，在纸的一端距边缘2－3cm处用铅笔划线，每隔2cm做一个记号用毛细管将各氨基酸样品分别点在这四个位置，干后再点一次用別针缝成筒状，将盛有20ml扩展剂大额培养皿迅速置于密闭的层析缸中并将滤纸直立于培养皿中，待溶剂上升15－20cm时取出滤纸，用铅笔描处溶剂前沿界限，自然干燥或用吹风机热风吹干用喷雾器均匀喷上0.1％茚三酮正丁醇溶液,置于烘箱中烘烤5min（100℃）或用热吹风吹干计算各种氨基酸的Rf值柱层析色谱柱常用玻璃柱（可直接观察色带移动情况）；工业上大型色谱柱可用金属制造（其上可嵌一条玻璃或有机玻璃夹带，利于观察；柱层析示意图固定液载气迁移平衡固定液载气固定相流动相吸附层析技术原理利用吸附剂对混合试样各组分的吸附力不同而使各组分分离。固定相特性吸附层析技术氧化铝-O-Si-O-Si-O-HO-H-O-Al-O-Al-O-HO-H-CH2-N-C-CH2-OH应用：有机溶剂中分离天然成分硅胶聚酰胺固定相表1：各种吸附剂对于极性有机物的吸附作用强度常用吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭等（表1）。纤维素、淀粉硅酸镁硫酸钙硅胶弗罗里硅土氧化镁中性氧化铝活性炭对极性有机物的吸附作用增强1、层析剂(固定相)特性不溶于流动相，有较好化学稳定性和机械强度；有较大的表面积和孔隙度，粒度、孔径分布均匀；较好的回收率和负载量，能达分离效率，重现性好；有较好的热稳定性；无毒性，不引起产物变性或失活；成本低，价格合理。吸附柱层析流动相的选择“相似相洗”的基本原则强极性的组分容易被吸附，应选择极性较强的流动相（强极性的流动相具有强的洗脱作用），反之则选择弱极性的流动相洗脱（非极性流动相，洗脱作用弱）。常见功能团极性顺序/常用流动相极性顺序P-112分配层析技术分配层析技术分配层析是根据欲分离组分在两种互不混溶或部分混溶的溶剂间溶解度的差异来实现的。固定相载体流动相要素一种溶剂是流动相另一种溶剂被吸收在载体上，在层析过程中不流动，称为固定相分配层析技术载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体载体种类：硅胶纤维素硅藻土30µm15µm5µm装柱湿法装柱干法装柱干法装柱层析柱材料——玻璃或者塑料制管处理好的吸附剂通过漏斗加入管内装完后在吸附剂表面铺一层滤纸打开下旋塞加入洗脱剂柱的装填好坏，对分离效果影响很大；柱装填不均匀，引起不规则流型；边装边敲打玻璃柱湿法装柱加入洗脱剂打开下旋塞处理好的吸附剂通过漏斗缓缓加入管内注意控制流速薄层层析法第二部分、薄层色谱法1.原理和特点[原理]:当展开剂从薄板上固定相的空隙中通过时,由于各组分的K的不同和足够多次的分配.[特点]:•装置简、操作方便•展开时间短•样品负荷量大、斑点扩散少薄层层析操作要点铺板点样点样量展开显色[缺点］：Rf值的重复性差[克服办法］：标样和试样在同一块板上展开•同一张色谱图可用不同的试剂显斑，也可用浓硫酸等强氧化剂或在400～500ｏＣ加热碳化检出2.吸附剂（固定相）决定吸附性能的因素：吸附剂的化学组成、活性、表面积［要求］：•合适的吸附力•与展开剂、被吸附物质均不起化学反应•粒度细小而且均匀（范氏方程，减少涡流扩散项）(1).氧化铝氧化铝呈微弱碱性，酸性较强的化合物在氧化铝上吸附的很牢（所以，酸性物质分离不好），故通常用于分离碳氢化合物、生物碱类和对碱性物质比较稳定的中性物质、碱性物质。氧化铝的活性与含水量密切相关（含一定量的水份时，吸附剂表面的吸附中心回被水分子占据）硅胶的结构为:HOSi(OSi)OSiOHOHOHOHOHOHOHn(2).硅胶【薄层色谱操作步骤】1、薄层板的制备（湿板的制备）薄层板制备的好坏直接影响色谱的结果。薄层应尽量均匀且厚度要固定。否则，在展开时前沿不齐，色谱结果也不易重复。在烧杯中放入2g硅胶，加入5—6ml蒸馏水，调成糊状。将配制好的浆料倾注到清洁干燥的载玻片上，拿在手中轻轻的左右摇晃，使其表面均匀平滑，在室温下晾干后进行活化。也可买市售的硅胶板切割成适宜大小备用。本实验用此法制备薄层板：吸附剂为硅胶G，用0.5%的羧甲基纤维素钠水溶液调成浆料。2、点样先用铅笔在距薄层板一端1cm处轻轻划一横线作为起始线，然后用毛细管吸取样品，在起始线上小心点样，吹干。斑点直径一般不超过2mm。若因样品溶液太稀，可重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，以防样点过大，造成拖尾、扩散等现象，而影响分离效果。若在同一板上点几个样，样点间距离应为0.5-1cm，且不能离边沿太近。点样要轻，不可刺破薄层。当展开剂到达距离另一端0.5cm处时拿出薄板，用铅笔将最远处做好记号，吹干样品点，测量l1、l0，计算Rf（３）展层薄层的展开需在密闭的器皿中进行，密闭容器应用展开溶剂予先饱和。展开方式和纸层析相同。但不加粘合剂的薄板只能作近水平式（与平面成20~10oC角）的上行或下行的展层而不能垂直展层。把点好样品的薄板浸入0.5cm深的适宜展开剂中，当展开剂移动至离起点约10~20cm处(约30min)，将薄板取出放平，用铅笔或小针记下溶剂前沿的位置后，在室温干燥或烘箱内干燥，测其Rf值。注意：每次的展层距离要固定，以便Rf值的重复（４）检出a.本身是有色物，可以直接观测斑点的位置和颜色b.本身无色但在紫外线的照射下会发出不同颜色的荧光c.薄板本身有荧光（硅胶HF254+366,硅胶GF254,......),欲测物吸收紫外线,在荧光背景下呈暗色主要显色试剂试剂配制及使用方法检出范围浓H2SO4喷雾,100~120oC,观察颜色变化高级醇、醛、酮、甾体H2SO4-K2Cr2O75gK2Cr2O7+100mLH2SO4,喷雾,280oC观察颜色变化全部有机物2’,7’-二氯荧光黄(0.2%乙醇)喷雾，紫外线照射全部有机物I2-KI1gI2+10gKI溶于50mLH2O中，加入2mLHAc，稀释至100mL，喷雾生物碱试剂配制及使用方法检出范围溴甲酚绿0.04g溶于100mL乙醇中，以0.1mol/LNaOH调至蓝色刚消失，pH3.6显黄色羧基酸Ag(NH3)2+2.6gAgNO3溶于50mL水，加入NH3H2O至沉淀刚好消失还原性物质、醛、还原糖茚三酮0.5%丙酮溶液胺类（如麻黄碱、氨基酸等）FeCl31g溶于100mL酚羟基、鞣质、黄酮磷钼酸5g溶于100mL95%乙醇脂肪、甾类、类脂、三萜酸、生物碱3.薄层色谱应用⑴可用于判断两个化合物是否相同（同一展开条件下是否有相同的移动值）；⑵可用于确定混合物中含有的组分数；⑶可用于为柱色谱选择合适的展开剂，监视柱色谱分离状况和效果；⑷可用于检测反应过程。影响Rf的因素Rf的大小取决于溶质在二相间的分配系数及滤纸的性质.不同的组分具有不同的分配系数,因而也就有不同的Rf.这就是定性的依据.(1).欲分离物的本性:物质在两相的分配系数,决定了它的Rf大小;(2)层析溶剂:同一组分在不同溶剂中Rf不