21酶的生物合成法生产

第二章酶的生物合成与发酵生产提取分离法微生物细胞发酵产酶酶的生产方法生物合成法植物细胞发酵产酶化学合成法动物细胞发酵产酶第一节酶生物合成及调节一、酶的生物合成遗传信息传递的中心法则转录传递给RNA，再由RNA蛋白质翻译转录逆转录复制复制DNARNA☆（一）RNA的生物合成--转录(transcription)定义以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA分子的过程。.☆转录模板启动子（promotor)终止子(terminator)模板链（templatestrand）反意义链(antisensestrand)编码链(codingstrand)有意义链(sensestrand)DNA5´5´3´3´反意义链:指导转录作用的一条DNA链有意义链:无转录功能的一条DNA链.☆TCGAGTACAGCTCATGCGAGUACRNA聚合酶有意义链反意义链RNAPPi5’5’3’GTPUTPCTPATPUTPRNA在DNA模板上的生物合成3’3’5’☆RNA的转录过程(三步)分子生物学讲1.起始2.延长3.终止原核生物的RNA聚合酶(DDRP)E.coli的RNA聚合酶是由四种亚基组成的五聚体（2）αββ'α核心酶（coreenzyme）σ全酶（holoenzyme）αββ'ασ起始因子RNA合成过程起始双链DNA局部解开磷酸二酯键形成终止阶段解链区到达基因终点延长阶段53RNA启动子（promotor)终止子(terminator)5RNA聚合酶5353553离开RNA链的延伸图解3´5´RNA-DNA杂交螺旋聚合酶的移动方向新生RNA复链解链有义链模板链（反义链）延长部位定义以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程。（二）蛋白质的生物合成--翻译(translation)☆AUGACA5’蛋苏UGUGUU3’受位(A位)给位(P位)大亚基小亚基☆蛋白质的合成过程（大肠杆菌）1基酸的活化2肽链合成的起始3肽链的延伸4肽链合成的终止与释放分子生物学讲1氨基酸的活化与转运反应式：AA+tRNA+ATP氨酰-tRNA合成酶氨酰-tRNA+AMP+PPi对于E.coli而言，肽链合成时的第一个氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMet）。2肽链合成的起始阶段●mRNA与小亚基结合：形成30S-mRNA-IF3复合物●AUG与蛋氨酰-tRNA结合：30S-mRNA-IF3fMet-tRNA-IF2-GTPfMet-tRNA正好位于mRNA的起始密码子上（AUG）。●大小亚基结合IF130S起始复合物AUGACA5’3’AUGACA5’3’UACUACAUGACA5’3’小亚基mRNA蛋氨酰tRNAGTP大亚基GDP+Pi受位给位蛋蛋肽链合成的起始阶段3肽链合成的延伸阶段●进位:氨基酰-tRNA进入受位;●转肽:形成肽键,在转肽酶作用下,给位与受位结合;●移位:核蛋白体向3’端移动一个密码子的位置,空出受位,不断地进位、转肽、移位,使肽链延长。AUGACA5’3’UAC蛋苏UGUAUGACA5’UAC蛋苏UGUGUUAUGACA5’UAC蛋苏UGUGUUAUGACA5’蛋苏UGUGUU3’3’3’GTPGDP+PiGDP+PiGTP起始复合体进位转肽移位Mg+K+4肽链合成的终止阶段●出现终止密码并与终止因子结合;●肽键水解,多肽释放;●tRNA,mRNA,大小亚基解离.AUGUAA5’UACAUGUAA5’UAC3’3’终终AUGUAA5’UAC3’终5’3’UAC终肽链二、酶生物合成的调节定义：通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。☆操纵子定义——基因表达的协同单位操纵子结构基因（编码蛋白质,structuralgene,S）控制部位操纵基因（operatorgene,O）启动子（promotorgene,P）（一）基因调控理论JacobandMonod的操纵子学说（operontheory）☆基因操纵子调节系统示意图调节基因启动基因操纵基因结构基因DNA转录（-）RNA聚合酶（+）转录翻译mRNA翻译阻遏蛋白蛋白质诱导剂控制区信息区操纵子☆RPOSDNACRP-cAMP复合物CRP+cAMPcAMP-CRP复合物的作用示意图●启动基因（promotorgene）（启动子）：有两个位点：（1）RNA聚合酶的结合位点（2）cAMP-CAP的结合位点。CAP：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolitegeneactivatorprotein），又称环腺苷酸受体蛋白(cAMPreceptorprotein，CRP）。只有cAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，RNA聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。●操纵基因（Operatergene）:位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。●结构基因（Structuralgene）:决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。●调节基因(regulatorgene)：可产生一种组成型调节蛋白(regulatoryprotein)（一种变构蛋白），通过与效应物(effector)（包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。调节基因常位于调控区的上游。(二)酶合成调节的类型1.诱导(induction)组成酶：细胞固有的酶类。诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。2.阻遏(repression)分解代谢物阻遏(cataboliterepression)反馈阻遏(feedbackrepression)☆（三）酶合成的调节机制1.酶合成的诱导:加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。如：已知分解利用乳糖的酶有：-半乳糖苷酶；-半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验:大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。☆调节基因操纵基因乳糖结构基因PLacZLacYLacamRNA阻遏蛋白（有活性）基因关闭启动子ORPLacZLacYLaca调节基因操纵基因乳糖结构基因启动子ORmRNAZmRNAYmRNAa阻遏蛋白（无活性）基因表达mRNAA、乳糖操纵子的结构B、乳糖酶的诱导乳糖诱导☆2.末端产物阻遏:由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。酶合成阻遏的现象：实验：大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。☆色氨酸操纵子——酶的阻遏调节基因操纵基因结构基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达调节基因操纵基因结构基因辅阻遏物代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构基因不能表达☆酶的诱导和阻遏操纵子模型B.有活性阻遏蛋白加诱导剂A.有活性阻遏蛋白C.无活性阻遏蛋白D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂操纵基因启动基因调节基因结构基因阻遏蛋白(有活性)阻遏蛋白阻挡操纵基因结构基因不表达诱导物诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起到阻挡操纵基因的作用,结构基因可以表达酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操纵基因结合,结构基因可以表达阻遏蛋白(无活性)酶蛋白mRNA代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达代谢产物调控方式阻遏蛋白添加物与操纵基因结合阻遏效应举例酶的诱导有活性－＋不转录，继而不翻译诱导物－转录，继而翻译乳糖操纵子酶的阻遏无活性－阻遏物＋不转录，继而不翻译色氨酸操纵子酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比3.分解代谢物阻遏指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。☆分解代谢物阻遏现象：实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”(diauxie或biphasicgrowth）。02468020406080细胞浓度(OD)时间(h)这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（CRP）,亦称降解物基因活化蛋白（CAP）。☆分解代谢物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基因表达CAP基因结构基因TCAPOCAP结合部位RNA聚合酶TcAMP-CAPP葡萄糖分解代谢产物腺苷酸环化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5'-AMP抑制激活葡萄糖降解物与cAMP的关系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白（catabolicgeneactivationprotein）降低cAMP浓度使CAP呈失活状态三、提高酶产量的策略（一）菌种选育（一劳永逸）1.诱变育种(1)使诱导型变为组成型——选育组成型突变株(2)使阻遏型变为去阻遏型选育营养缺陷型突变株解除反馈阻遏选育结构类似物抗性突变株解除分解代谢物阻遏—选育抗分解代谢阻遏突变株2.基因工程育种☆（二）条件控制1.添加诱导物酶的底物类似物最有效。2.降低阻遏物浓度除去终产物产物阻遏添加阻止产物形成的抑制剂避免使用葡萄糖分解代谢物阻遏避免培养基过于丰富添加一定量的cAMP☆3.添加表面活性剂离子型对细胞有毒害作表面活性剂Tween－80非离子型增加细胞通透性TritonX－1004.添加产酶促进剂☆思考题:1名词:诱导物终产物阻遏分解代谢产物阻遏葡萄糖效应2举例说明酶生物合成调节机制在酶发酵过程优化中的指导意义.3举例说明酶生物合成调节机制在产酶微生物菌种改造中的指导意义.4在酶的发酵过程中,提高酶产量的措施有哪些?5说说微生物产酶菌种的要求6如果筛选酸性蛋白酶高产菌株,如何进行筛选?7结合酶生物合成模式,谈谈如何提高酶的合成量?☆