第四章 细胞化学染色

第三章血细胞化学染色第一节概述以细胞形态学为基础，根据化学反应的原理，应用涂片染色的方法，对血细胞内的各种化学成分及其变化作定性、定位、半定量的分析。一、研究对象外周血和骨髓新鲜涂片单个细胞中的化学物质：酶类、脂类、糖类、铁、蛋白质、核酸等二、基本步骤固定保持细胞结构和化学成分显示被染的化学物质最终形成稳定的有色沉淀复染显示各种细胞，其颜色与有色沉淀的颜色有明显的对比度三、临床应用1.鉴别各类血细胞2.辅助血液系统等疾病诊断和鉴别诊断3.观察疾病疗效和判断预后第二节常用细胞化学染色方法过氧化物酶染色中性粒细胞碱性磷酸酶染色过碘酸-雪夫反应α-醋酸萘酚酯酶染色铁染色一、过氧化物酶染色（peroxidase，POX）髓过氧化物酶（marrowperoxidase,MPO)血细胞主要的POX,是人类中性粒细胞含量最多的蛋白质，主要功能是破坏生物氧化过程中有剧毒的过氧化物。POX新生态氧[O]↑过氧化氢（基质中）二氨基联苯胺（无色）粒、单核细胞胞浆【原理】棕黄色沉淀（浆内酶部位）【结果判断】阴性无颗粒弱阳性颗粒小，分布稀疏阳性颗粒稍粗，分布较密集强阳性颗粒粗大，密布于整个胞浆【正常血细胞染色反应】1.粒细胞系统POX主要存在于粒系细胞中。分化差的原粒细胞阴性;分化好的原粒细胞至中性成熟粒细胞各阶段均呈阳性，阳性反应程度随细胞的成熟逐渐增强。2.单核细胞系统阴性或弱阳性3.淋巴细胞系统红细胞系统巨核细胞系统阴性浆细胞组织细胞【临床意义】临床上是辅助判断急性白血病首选的、最重要的细胞化学染色急性髓细胞白血病急性淋巴细胞白血病鉴别1.急性髓细胞白血病（1）急性粒细胞白血病阳性反应：M3M2bM2aM1（分化差的原粒细胞呈阴性反应）（2）急性单核细胞白血病弱阳性反应（分化差的原单核细胞呈阴性反应）2.急性淋巴细胞白血病阴性反应或阳性率3%(残留的原粒细胞)二、中性粒细胞碱性磷酸酶染色（neutrophilicalkalinephosphatase，NAP）磷酸萘酚钠（基质中）中性粒细胞胞浆中NAP磷酸钠α-萘酚重氮盐（坚牢蓝盐RR）＋紫黑色偶氮染料（胞浆中）水解【原理】Kaplow偶氮偶联法【结果判断】胞浆中有紫黑色颗粒为阳性(+～++++）【正常血细胞染色反应】1.中性成熟粒细胞（杆状和分叶）阳性反应其他细胞呈阴性反应2.NAP积分值油镜下计数100个成熟中性粒细胞（杆状和分叶）,分别记录其分级情况：(-)0分(+)1分(++)2分(+++)3分(++++)4分阳性率全部阳性反应细胞之和积分值各种阳性程度细胞的分值之和3.参考值积分值40~80分阳性率10%~40%(各实验室参考值不同)【临床意义】病理性变化：（1）细菌性感染与病毒性感染（尤其是化脓性感染）明显增加无明显变化(2）类白血病反应与慢性粒细胞白血病明显增加明显下降且常为零分，缓解时又上升到正常（3）再生障碍性贫血增加阵发性睡眠性血红蛋白尿下降三、过碘酸-雪夫反应(糖原染色)（periodicacid-Schiffreaction，PAS）双醛基过碘酸雪夫试剂中的无色品红紫红色化合物(附于含多糖类的胞浆内)乙二醇基(多糖类物质含有)氧化【原理】【结果判断】阳性胞浆内出现红色阳性物，呈弥漫均匀红色、颗粒状或小块状。阴性胞浆内无色,核淡绿。用阳性率报告结果，并说明阳性物的形态。【正常血细胞染色反应】1.粒细胞系统分化差的原粒细胞为阴性；分化好的原粒细胞至中性分叶核粒细胞各阶段均呈阳性反应，阳性程度随细胞的成熟逐渐增强。阳性物呈细颗粒、均匀红色。2.红细胞系统阴性3.单核细胞系统细颗粒状，有时分布于细胞边缘的阳性颗粒较粗大。4.淋巴细胞系统大多数淋巴细胞呈阴性；少于20%淋巴细胞呈粗颗粒状或块状阳性。5.巨核细胞系统呈颗粒状或块状阳性（含血小板）。【临床意义】1.红细胞疾病:恶性疾病呈阳性，良性疾病，呈阴性。红血病或红白血病幼红细胞阳性巨幼细胞性贫血幼红细胞阴性骨髓增生异常综合征幼红细胞阳性再生障碍性贫血幼红细胞阴性2.鉴别急性白血病类型（1）急性淋巴细胞白血病阳性率20%～80%，呈红色粗颗粒状或块状。（2）急性粒细胞白血病少数阳性，呈细颗粒状或均匀红色。（3）急性单核细胞白血病可阳性，呈细颗粒状、弥散分布，有时胞质边缘处颗粒较粗大。（4）巨核细胞白血病阳性或强阳性反应，表现为红色颗粒或块状。3.其他细胞戈谢细胞呈强阳性（葡萄糖脑苷脂在单核-吞噬细胞积聚）尼曼-匹克细胞呈阴性或弱阳性（鞘磷脂在单核-吞噬细胞积聚）四、α-醋酸萘酚酯酶染色（α-naphtholacetateesterase，α-NAE）酸性α-醋酸萘酚酯酶（T淋巴细胞、单核-巨噬细胞）α-醋酸萘酚酯酶（α-NAE）非特异性（单核细胞、粒细胞、淋巴细胞）α-丁酸萘酚酯酶（单核细胞、巨噬细胞）醋酸AS-D萘酚酯酶（AS-DNAE)（单核细胞、粒细胞、淋巴细胞）特异性氯乙酸AS-D萘酚酯酶(AS-DNCE)（粒细胞）酯酶α-醋酸萘酚酯酶（细胞内）α-醋酸萘酚（基质液中）α-萘酚重氮盐（坚牢蓝B）胞浆不溶性灰黑色或棕黑色沉淀水解【原理】【结果判断】胞浆内有灰黑色或棕黑色弥散性颗粒状沉淀为阳性。氟化钠抑制试验在基质液中加入适量NaF,其余染色方法同上。两种方法染色后用油镜计数100或200个被检细胞，分别计算出抑制前和抑制后的阳性率或阳性积分。氟化钠抑制率=抑制前阳性率或阳性积分-抑制后阳性率或阳性积分抑制前阳性率或阳性积分×100%【正常血细胞染色反应】1.单核细胞系统原始单核细胞分化差阴性分化好阳性幼稚及成熟单核细胞阳性被氟化钠抑制2.粒细胞系统原粒细胞阴性或弱阳性以下阶段为弱阳性3.淋巴细胞系统多数阴性，少数弱阳性不被氟化钠抑制【临床意义】急单急粒急性早幼粒急粒单急淋α-NAE+++或-或++阳性-或+++++弱+NaF被抑制不被不被抑制部分被抑制抑制部分未被抑制主要用于鉴别急性白血病类型五、α-丁酸萘酚酯酶染色2.原理细胞内的α-丁酸萘酚酯酶(α-NBE)在碱性条件下，将基质中的α-丁酸萘酚水解，产生α-萘酚，再与重氮盐偶联，生成不溶性的有色沉淀，定位于酶活性所在处。α-丁酸萘酚酯酶（细胞内）α-丁酸萘酚酯（基质液中）α-萘酚重氮盐（坚牢蓝B）胞浆不溶性灰黑色或棕黑色沉淀水解【原理】参考值粒细胞系统：各阶段均阴性单核细胞系统：原单阴性，余均阳性，但被氟化钠抑制淋巴细胞系统：B淋巴细胞均阴性，余可阳性其他细胞：可阳性，不被氟化钠抑制5.临床意义：1）鉴别急性白血病类型：AMOL时，原始单核细胞可呈阳性反应，幼单核细胞和成熟单核细胞呈强阳性反应，但能被氟化钠抑制(抑制率在50%以上)；AML时，原始粒细胞一般呈阴性反应，少数呈阳性反应，但不被氟化钠抑制或仅部分轻度抑制；ALL时，原始淋巴细胞和幼淋巴细胞呈阴性反应，T-ALL原始淋巴细胞可呈阳性反应，但不被氟化钠抑制。2）鉴别急性单核细胞白血病和组织细胞白血病：异常组织细胞可呈阳性反应，但此酶不能被氟化钠抑制；急单时，白血病细胞的阳性反应可被氟化钠抑制。六、铁染色（ferricstain）正常人骨髓中的贮存铁存在的方式：骨髓小粒中的含Fe血黄素—骨髓单核-巨噬细胞内（细胞外铁）铁蛋白—幼红细胞内（细胞内铁）亚铁氰化钾亚铁氰化铁(蓝色沉淀在含Fe部位)铁＋酸性环境普鲁士蓝反应原理【结果判断】细胞外铁低倍镜观察涂片尾部和骨髓小粒,细胞外铁位于幼红细胞外或骨髓小粒巨噬细胞浆内，呈蓝色颗粒状、小珠状或团块状。再用油镜判断阳性程度，根据铁量多少分五级:（-）（+）（++）（+++）（++++）细胞内铁幼红细胞核染色为鲜红色,铁粒呈蓝绿色。油镜下计数100个中幼红细胞和晚幼红细胞，记录胞浆中含有蓝色颗粒细胞的百分率。根据细胞内铁颗粒的数目、大小、染色深浅和颗粒分布情况,将铁粒幼红细胞分为四型:Ⅰ型(1-2)Ⅱ型(3-5)Ⅲ型(6-10)Ⅳ型(11以上)铁粒幼红细胞胞质中出现蓝色铁颗粒的幼红细胞。环铁粒幼红细胞幼红细胞胞质内蓝色铁颗粒在6颗以上，并围绕核周1/2以上者。铁粒红细胞成熟红细胞出现蓝色铁颗粒。1.细胞外铁+～++，约2/3人为++，约1/3人为+。2.细胞内铁阳性率19%～44%Ⅰ型为主，少数为Ⅱ型（无环形铁粒幼红细胞和铁粒红细胞）【参考值】【临床意义】1.诊断缺铁性贫血、指导铁剂治疗细胞内、外铁明显减低甚至消失，经铁剂治疗有效后，其细胞外铁、内铁先后增多。2.诊断铁粒幼细胞性贫血铁粒幼红细胞、环形铁粒幼红细胞均增多，细胞外铁也常明显增多。(与血红素合成有关的酶和辅酶缺乏或活性降低铁利用障碍、血红素合成障碍、红细胞无效生成）3.骨髓增生异常综合征（MDS）伴环形铁粒幼红细胞增多的难治性贫血（RARS亚型），其环形铁粒幼红细胞大于0.15。正常骨髓细胞各染色结果对比表染色方法红系粒系单核系淋巴系巨核系POX阴性阳性弱阳性阴性阴性NAP阴性阳性阴性阴性阴性PAS阴性阳性阳性阴性/阳性阳性NAS-DCE阴性阳性阴性阴性阴性ɑ-NBE可阳性阴性阳性可阳性可阳性POX:粒细胞，单核细胞NAP:杆状核、分叶核NAS-DCE：粒细胞，单核细胞ɑ-NBE：单核细胞PAS:除红细胞系统外，均可常用的细胞化学种类和意义1．掌握常用细胞化学染色方法的结果判断和临床意义。2．熟悉常用细胞化学染色方法的原理。本章目的要求