微生物在药学中的应用

第三篇微生物在药学中的应用微生物与药学的关系密切:1、许多抗生素是微生物的代谢产物,2、选用微生物来制造医药卫生方面广泛应用的药物,如维生素,辅酶；3、药品卫生质量的控制需要进行微生物学检验；4、药品和生物制剂应用生物工程技术生产时，采用工程菌进行，如：胰岛素、干扰素和生长因子等。随着微生物学基础理论和实验技术的发展，微生物在药学领域应用越来越广。在医药生产中已广泛利用微生物发酵来制备各种药物，形成一门独立的微生物药物学科。发酵（fermentation）：原来是指在厌氧条件下酵母菌分解碳水化合物释放能量以及得到产物的过程，但目前工业上把发酵扩展为利用培养微生物来制得产物的任何过程，其中也包括利用微生物的某些酶来转化某些物质使之成为所需物质的过程.。发酵（fermentation）：原来是指在厌氧条件下酵母菌分解碳水化合物释放能量以及得到产物的过程，目前工业上把发酵扩展为利用培养微生物来制得产物的任何过程，其中也包括利用微生物的某些酶来转化某些物质使之成为所需物质的过程.。发酵的分类：根据发酵时所需条件1、是否需要氧气厌氧发酵与需氧发酵2、培养基的物理性状固体发酵与液体发酵3、工艺浅层发酵与深层发酵现代生物技术的发展，使发酵工业的范畴突破了利用天然微生物的传统发酵，逐步建立起新型的发酵，可生产天然微生物所不能产生或产生很少的特殊产物。本篇主要内容：1、介绍微生物发酵制品包括抗生素、维生素、氨基酸、酶和酶抑制剂。2、微生物与药物变质的关系以及保证药物制剂质量所必需的各种微生物学检验法。如:抗生素效价的微生物学检定;药物抗菌活性的测定;第十七章抗生素共生现象：互相依存，作为整体如：根瘤菌与豆科植物拮抗：生活在一起，一种生物产生物质抑制或杀灭另一种生物。抗生素就是拮抗现象的体现。Fleming于1929年首先发现从青霉菌中产生的青霉素（penicillin），Waksman于1944年发现从链霉菌中产生的链霉素（streotomycin）。抗生素的现状目前从自然界发现和分离的抗生素已达10，000多种，实际应用于生产和医疗上的抗生素约有一百多种，连同各种半合成衍生物及其盐类共约三百种。国外现有的主要抗生素在我国已有生产，其中的庆大霉素用我国自行分离的菌种生产。国外没有的抗生素如创新霉素国外虽有，但我国发现新的成分或新的用途如平阳霉素（或博来霉素）第一节抗生素的概念和分类一、抗生素的概念抗生素是指青霉素、链霉素等一类化合物的总称，是人类控制、治疗感染性疾病，保障身体健康及用来防治动植物灾害的重要化合物。原始含义：是指那些由微生物产生的、能抑制其微生物生长的物质。习惯上：将那些由微生物产生的，极微量即具有选择性地抑制其他微生物或肿瘤细胞的天然有机化合物称为抗生素。确切的含义：抗生素是生物（包括微生物、植物和动物）在其生命活动中产生的（或由其他方法获得的），能在低浓度下有选择地抑制或影响其他生物机能的有机物。几个注意点：确切含义是只有来自微生物的天然产物才能称为抗生素，而现在把经化学改造的天然来源的抗生素或微生物代谢的其他产物均称为半合成抗生素。抗生素：是一个低分子量（指一个分子有一定的化学结构，其相对质量最大可达数千）的微生物代谢产物，在低浓度（﹤1mg/ml）时能抑制其他微生物生长。医疗用抗生素需要以下要求：1、差异毒力大是指微生物或肿瘤细胞等靶体的抑制或杀灭作用，与其对机体损害程度的差异比较。抗生素的差异毒力愈大，则愈有利于临床应用。如青霉素能抑制细菌细胞壁的合成，而人及哺乳类动物细胞不具备细胞壁，因而青霉素的差异毒力大。一般的化学消毒剂对微生物和机体的毒力无明显差异。2、生物活性强大、有不同的抗菌谱是指在极微量的抗生素就对微生物具有抑制或杀灭作用。抗菌作用的强弱用最低抑菌浓度（MIC）来表示，即能抑制微生物生长所需的最低浓度（以μg/ml为单位），数值越小，则作用越强。抗菌谱：是指抗生素所能抑制或杀灭微生物的范围和所需剂量。范围广者称为广谱抗生素，范围窄称为窄谱抗生素。良好的抗生素还应具有不易使病原菌产生抗药性，毒副作用小，不易引起超敏反应，吸收快，血药浓度高，不易被血清蛋白结合而失活。二、抗生素的分类目前尚无完善的系统分类方法1、根据抗生素的产生来源（1）细菌产生的抗生素如多粘菌素和短杆菌肽（2）放线菌产生的抗生素主要来自链霉菌属如:链霉素、卡那霉素、四环素（3）真菌产生的抗生素如青霉菌属产生的青霉素，头孢菌属产生的头孢菌素（4）植物和动物产生的抗生素如:地衣和藻类植物产生的地衣酸被子植物蒜中制得的蒜素动物脏器中制得的鱼素2、根据抗生素的化学结构分类（1）β-内酰胺类抗生素如：青霉素、头孢菌素[特点]分子中有一个含四个原子的酰胺环，化学上称为β-内酰胺环。[来源]它们起初是从真菌产黄青霉菌和头孢菌属中发现，后来从放线菌的链霉菌属和诺卡菌属及其某些革兰阴性菌中也发现。从生物合成角度看，被认为是从氨基酸聚合而衍生的。[机制]抑制细菌细胞壁基本成分肽聚糖的合成，导致不可逆转的破坏，具有杀菌作用。早期的青霉素只对革兰阳性和阴性菌有效。对真菌无用（细胞壁不含肽聚糖），对支原体无效（无细胞壁）[使用注意问题]除个别外，此类抗生素的毒性非常低。有时出现极为严重的超敏反应。（2）四环类抗生素如金霉素、土霉素和四环素[特点]具有很广的抗菌谱及较好的治疗果[来源]不同种的链霉菌均能产生四环素类抗生素[结构特点]由乙酸和丙二酸单位缩合的键环化而形成；由四个环线形相连而组成。[作用特点]抑制核糖体蛋白的合成，其作用是可逆的，因此具有抑制作用。抗菌谱广即革兰阳性与阴性菌、立克次体、衣原体和某些原虫。由于其理化性质（在中性PH条件下不溶水）所决定，天然产生的只能口服，化学半合成获得了一些可用于注射的衍生物及作用周期较长的。（3）氨基糖苷类抗生素（氨基环醇类）[来源]包括很广的由链霉菌、小单孢菌和芽孢杆菌产生的物质。[化学特征]具有环状氨基醇和与之相连的氨基糖。葡萄糖是氨基醇和氨基糖的来源。[作用机制]以不可逆的方式作用于核糖体而抑制蛋白质的合成，具有杀菌作用，主要作用革兰阳性菌。[代表药物]链霉素（第一个发现，也是第一个对抗生素有效的抗生素）、卡那霉素、庆大霉素、妥布拉霉素和丁安卡那霉素。[特点]由于分子内含许多羟基，此类抗生素水溶性非常好，因而不能口服，主要的副作用为肾和耳毒性。（4）大环内酯类抗生素[化学结构特点]具有一个由不少于12个碳原子，并由内脂基团使其环化。他们是链霉菌的典型产物，其生物合成是由一系列乙酸和丙酸单位缩合而成。[分类与作用特点]分两类a、抗细菌大环内酯类抗生素由14-16个碳原子构成的内酯环，至少有两个糖分子；具有抑菌作用；抗菌谱局限于革兰阳性菌和支原体；典型代表是红霉素、竹桃霉素；为改善口服吸收率，还半合成了一些新的衍生物。b、抗真菌和抗原虫大环内酯类抗生素[特征]由约30个原子组成内酯类，带有羟基取代基团包含一系列共轭的双键，也称为多烯类化合物，只有静脉注射才有活性。[机制]通过干扰细胞膜甾醇类合成诱导细胞膜畸变，因此对细菌无作用。毒副作用较大，因而只能有限的用于最需要的病例。[代表药物]两性霉素B(5)肽类抗生素由氨基酸组成，经常形成环状结构；主要对革兰阳性菌。短肽菌肽主要干扰细菌细胞膜功能；杆菌肽主要抑制细胞壁肽聚糖的合成。[代表药物]多黏菌素---对革兰阴性菌有效，作用于细胞膜；肽托霉素和雷膜拉宁—对细胞壁合成抑制作用。（6）安莎霉素类60年代末期投入临床使用，其典型结构是具有一条脂肪链，连接两个相对的芳香环，像是一条链子上的两个篮子。它们由放线菌属的多种类群所构成，由一系列乙酸和丙酸单位缩合而成。如利福霉素（对革兰阳性菌及分枝杆菌有极强的作用）、利福平（对分枝杆菌及葡萄球菌效果尤佳）。（7）糖肽类抗生素（二丙庚肽类）代表药物为万古霉素和替考拉宁。主要对革兰阳性细菌有效，尤其是对耐β-内酰胺类抗生素的葡萄球菌有效。（8）抗肿瘤抗生素属于不同化学类别，但都以不同机制作用于DNA复制。放线菌素→由酚恶嗪酮环组成带有二个相同的肽环，它们以其芳香环与DNA碱基嵌合，而影响DNA功能，在其真核细胞中主要干扰RNA合成。蒽环类化合物（柔红霉素和阿霉素）→具有四环结构带有一个取代的糖基，作用于拓扑异构酶，使DNA断裂。丝裂霉素C→具有三环结构，使二个DNA链中间形成共价键桥。博来霉素→由轮生链霉菌产生的9肽混合物，以类酶反应使DNA链断裂。（9）其他抗生素氯霉素：抑制蛋白质合成，有抑菌作用，对革兰阴性细菌尤其沙门菌有很好的效果。林可霉素：抑制蛋白质合成。新生霉素：抑制DNA回旋酶的一个单位，作用革兰阳性菌和变形杆菌。灰黄霉素：可以在体内应用的抗真菌抗生素，由真菌产生，具有芳香环结构，生物合成是由乙酸和丙二酸单位缩合而成，抑制细胞支架的形成。第二节抗生素产生菌的分离和筛选目前新抗生素的获得途径：1、从自然界分离筛选新抗生素产生菌从土壤到海洋一般常见到极端微生物从微生物到植物、海洋生物。2、改造现有的已知抗生素的产生菌，再经筛选获得新得抗生素产生菌。3、从已知的抗生素进行结构改造，经筛选获得新的半合成抗生素。4、采用新的筛选方法如：应用定向生物合成和突变生物合成的原理，以及培养超敏细菌以寻找微量的抗生素，选用新的肿瘤模型来筛选抗肿瘤的抗生素。5、采用现代分子生物学技术产生新抗生素（1）基因克隆产生新抗生素：首先获得某已知抗生素的结构基因，然后通过一定的载体将基因片段导入特定的另一种抗生素产生菌中，则可能产生完全符合人们设计要求的新抗生素。（2）沉默基因的激活：引入抗生素生物合成的调控基因，有可能激发抗生素产生菌处于休眠状态或沉默状态的基因系统，从而开启另一结构抗生素的生物合成开关，得到新抗生素。绝大多数抗生素的原始产生菌是从自然界分离筛选获得，以传统的分离土壤放线菌为例，说明新抗生素产生菌的常规分离和筛选过程。一、土壤微生物的分离1、采土以春、秋两季采土为宜。去除表土，采取5-10cm深处的土壤，装入无菌容器。2、分离菌株将2-4克土壤均匀散布水中待其沉降，上清部分经适当稀释后（一般为10-3-104），涂布于适宜培养基中，并培养至单菌落出现，挑取单个菌落移种纯培养，根据菌落的特征，初步排除相同菌。二、筛选：是指从大量待筛选微生物中，尽快地鉴别出有实用价值的抗生素产生菌的实验过程。1、筛选模型：是指筛选工作中所使用的实验菌。为了避免感染病原菌的危险，尽可能选用非致病的、且能代表某些类型致病菌的微生物作为实验菌。表17-1常用的实验菌和代表的致病微生物实验菌代表的致病微生物金黄色葡萄球菌革兰阳性球菌枯草芽孢杆菌革兰阳性杆菌耻垢分支杆菌结核分枝杆菌大肠埃希菌革兰阴性杆菌白假丝酵母菌酵母状真菌曲霉丝状真菌噬菌体病毒、肿瘤细胞2、筛选方法抗菌抗生素一般采用琼脂扩散法。先制备含实验菌的平板，然后以无菌滤纸片蘸取各放线菌的摇瓶培养发酵液或切取一定大小的放线菌琼脂培养块，置于含菌平板上，培养后观察有无抑菌圈产生。三、早期鉴别经过筛选的阳性菌应进一步做抗菌谱和抗药谱的测定，对有价值的产生菌必须从产生菌及自该菌产生的抗生素两方面进行鉴定。1、抗生素产生菌的鉴别通过形态、培养、生化反应等实验对抗生素产生菌进行初步的分类鉴定。2、抗生素的鉴别常用理化方法如：纸层析法测定抗生素的极性和在各种溶媒中的溶解度。纸电泳法判断抗生素是酸性、碱性、中性或两性。薄层层析法、高效液相层析法、紫外分光光度法等方法测定新抗生素的理化性质和结构。四、分离精制将可能产生新抗生素的放线菌进行扩大培养，然后选择合适的方法从培养液中提取有效抗生素，进一步精制纯化。在此过程中，须跟综测定抗生素的生物活性。五、临床前实验研究如：进行动物毒性实验（急性、亚急性、慢性）动物治疗保护性实验临床前药效实验和药理实验（抗生素在体内吸收、分布、排泄），经系列实验认为确有前途的新抗生素经有关部门审查合格后方可进行临床实验。国家制定了《药品临床前研究质量管理规范》，（简称GLP）。六、临床实验《药品临床实验管理规范》简称GCP，是临床实验的全过程，包括方案设计、组织实施、监视、审核、记录、