免疫共沉淀技术

免疫共沉淀技术xxx实验室讨论Part1:IPPart2:CO-IPTHEENDPart3:CO-IP与质谱分析Part4:应用免疫沉淀定义Part1:IP免疫沉淀（immunoprecipitationIP）是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来。免疫沉淀步骤Part1:IP抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G（ProteinA/G），通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5-10min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。免疫沉淀原理图解Part1:IP免疫共沉淀定义Part2:CO-IP免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CO-IP）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。免疫共沉淀原理Part2:CO-IP免疫共沉淀原理图解Part2:CO-IP蛋白A，蛋白B抗A抗体C进行洗脱抗B抗体D进行验证IPCACO-IPCA+BDPart2:CO-IP1.相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；2.蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；3.可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。优点1.可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用2.两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；3.如用westernblot检验，必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果，实验本身具有冒险性。缺点实验的关键1.实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。2.为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。3.考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。Part3:CO-IP与质谱分析质谱法(MassSpectrometry,MS)，即用电场和磁场将运动的离子（带电荷的原子、分子或分子碎片）按它们的质荷比分离后进行检测的方法。测出了离子的准确质量，就可以确定离子的化合物组成。质谱分析CO-IP与质谱分析Part3:CO-IP原理：以细胞内源性靶蛋白为诱饵，用抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共沉淀纯化靶蛋白免疫复合物，凝胶电泳分离后，质谱鉴定靶蛋白的结合蛋白。Part3:CO-IPCO-IP与质谱分析流程Part4:应用•hPAK4为人P21活化激酶4，构建其3XFLAG-hPAK4真核质粒•转染COS-7细胞。•裂解细胞后用anti-Flag抗体免疫沉淀细胞裂解液，沉降hPAK4蛋白。•WB鉴定被沉降的目的的蛋白表达。3XFlag-hPAK4重组质粒的构建及其在COS7细胞中的表达与定位•P53基因为一种人体抑癌基因人体癌症发生约一半由于该的基因突变失活。•抗p53抗体与HNE1和HNE2总蛋白进行免疫共沉淀•SDS-PAGE分离免疫沉淀复合物•切取p53结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析，得到相应的肽序列标签•搜索数据库分析目的蛋白相关数据研究鼻咽癌细胞系中的p53相互作用蛋白•构建p3XFLAG-GCP和pCMV-myc-LGL质粒•两质粒共转染293T细胞•SDS-PAGE分离免疫沉淀复合物•用anti-Flag抗体共沉淀LGL蛋白，用anti-myc抗体验证。血吸虫抱雌沟蛋白与幼虫巨大致死基因作用•利用微孢子虫胞壁蛋白制备2株单抗，WB鉴定分别G10识别虫体蛋白的三种成分，B10识别55KD左右一种成分。•裂解虫体提取总蛋白利用制备的单抗进行免疫共沉淀•切取结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析，得到相应的肽序列标签•鉴定得出结论G10识别的70KD左右条带为热休克蛋白70，B10识别的是一种未曾报到的蛋白，分析得到其相关信息家蚕微孢子虫胞壁蛋白单克隆抗体靶蛋白的分离与质谱鉴定分析THEENDThankyou