0324细菌转化实验

•实验一细菌质粒DNA的提取和纯化•菌体pcr•跟普通PCR原理是一样的，因为94度变形可以裂解细菌，释放出DNA，所以不用提质粒也可以PCR出来条带•因为培养基含有水分，恒温培养时水分蒸发出来在培养皿盖上凝结，水滴落下来会冲坏菌落，不利于培养观察，所以需要倒置培养一、实验目的通过细菌质粒DNA的提取，掌握共价闭合环状DNA的提取方法。二、实验原理1.细菌中有两种DNA，即染色体DNA和质粒DNA。2.质粒DNA的提取方法有三种：碱裂解法、煮沸法和去污剂（如Triton和SDS）裂解法。3.碱裂解法比较剧烈，可破坏碱基配对，使宿主细胞DNA变性，共价闭合环状DNA由于空间缠绕，两条链不会彻底分开。当外界条件到达复性条件时，质粒DNA的双链又迅速恢复原状，而较大的线性染色体DNA难以复性。三、实验菌株含质粒载体pGEM-T的大肠杆菌（E.coli.）四、实验用具和药品实验用具–摇床、离心机、移液器及枪头、玻璃试管（15mL）及塞子、离心管（1.5mL）。LB培养基配方：ddH2O950mL细菌培养用胰化蛋白胨（bacto-tryptone）10g细菌培养用酵母提取物（bacto-yeastextract）5gNaCl10g琼脂粉（配制固体培养基时需加入）15gNaOH调节pH至7.0（5mol/L约0.2mL），高压灭菌固体平板上添加氨苄青霉素实验药品溶液Ⅰ（高压灭菌）：50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.Cl（pH8.0）10mmol/LEDTA（pH8.0）溶液Ⅱ（现用现配）：0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/L的溶液稀释）1%SDS溶液Ⅲ：5mol/L乙酸钾60mL冰乙酸11.5mL水28.5mL五、实验步骤方法：活化-扩增-离心-裂解-离心-抽提-沉淀-洗涤-溶解（一）细菌繁殖实验前2天晚上：将冻存的菌株取出，划线接种于LB（amp）平板上，置于37℃培养箱中，倒置培养至菌落长成。实验前1天晚上：•从LB平板上挑取单个菌落，接种于6mlLB液体培养基（加入氨苄青霉素）中，37℃，过夜振荡（200r/min）培养。（二）菌体收集实验当天：1.将过夜培养的菌体转入1.5mL离心管，5000r/min离心2min；2.弃上清（三）碱裂解法提取质粒DNA全套操作约需1小时，详细说明如下。3.加入250μl的SolutionⅠ（含RNaseA1）充分悬浮细菌沉淀。注）注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（Vortex）等剧烈振荡使菌体充分悬浮。4.加入250μl的SolutionⅡ轻轻地上下翻转混合5～6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。注）此步骤不宜超过5分钟。5.加入400μl的4℃预冷的SolutionⅢ，轻轻上下翻转混合5～6次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置2分钟。6.室温12,000rpm离心10分钟，取上清。注）此时4℃离心不利于沉淀沉降。7.将试剂盒中的SpinColumn（离心柱）安置于CollectionTube（收集管）上。8.将上述操作6的上清液转移至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。9.将500μl的RinseA加入SpinColumn中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。10.将700μl的Rinse（冲洗）B加入SpinColumn中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。11.重复操作步骤10。12.将SpinColumn安置于CollectionTube上，12,000rpm离心1分钟。13.将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入60μl的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer（洗脱缓冲液），室温静置1分钟。注）把灭菌蒸馏水或ElutionBuffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率14.12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。六、实验作业1.按上述实验步骤提取质粒DNA。1.思考本实验的关键步骤是什么？答：本实验的关键是溶液Ⅰ重悬须充分，溶液Ⅲ混合须温和。用bindingbuffer是为了增加洗脱柱对核酸的结合活性；washsolution是洗掉柱子里除核酸物质以外的杂质；而elutionbuffer就是最后把DNA从柱子上洗脱下来使用的溶液，一般是pH=8.0的TE，dd水也可以。实验二大肠杆菌的遗传转化一、实验目的通过实验了解原核生物实现基因转移的途径，掌握质粒DNA遗传转化的基本原理和操作方法。二、实验原理1.转化（transformation）是指一种生物由于接受了另一种生物（或同种生物）的遗传物质，从而获得了后者的某些遗传性状或发生遗传性状改变的现象。2.细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。3.用理化方法人工诱导细菌进入感受态的操作叫致敏过程。4.目前应用较广的转化方法有两种：CaCl2转化法（化学转化法）和电转化法。5.CaCl2转化法的原理是在低温（0℃）和低渗的CaCl2溶液中，菌体膨胀，转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细菌细胞表面，经42℃短时间热击，促进细胞吸收DNA复合物。三、实验材料1.质粒pGEM-Teasy：编码氨苄青霉素（Ampr）的抗性基因2.大肠杆菌（E.coli）DH5α菌株：氨苄青霉素敏感型（Amp-）四、实验用品1.超净工作台、摇床2.水浴锅、离心机3.分光光度计、移液器及枪头4.三角瓶（500mL、200mL）5.离心管（50mL、1.5mL）6.平板（Ampr、Amp-）、LB培养基7.冰冷的CaCl2溶液、质粒DNA0.1MCaCl2溶液配制：称量1.11g无水CaCl2固体，溶于1000ml双蒸水中，高压灭菌或0.22um滤器过滤除菌。保存于4度冰箱中。质粒的提取：利用质粒提取试剂盒提取质粒DNA。五、实验步骤（一）感受态的制备(此步骤已完成）1、E.Coli涂布于平板（Amp-），37℃，培养12h；2、挑取单菌落，转移至盛有200mLLB的500mL三角瓶中，37℃，振荡（200r/min）培养12h；3、吸取1mL菌液，转移至盛有100mLLB的200mL三角瓶中，37℃，振荡（200r/min）培养2~3h，每隔0.5h测OD600值；4、当OD600=0.3~0.4（对数生长期的OD600=0.6）取出；冰上放置10~60min；5、4℃，5000rpm，离心10min，弃上清；6、冰预冷的0.1mol/LCaCl210mL悬浮细胞；7、冰上放置15min；8、4℃，5000rpm，离心10min，弃上清；9、冰预冷的0.1mol/LCaCl22mL悬浮细胞；10、用于转化实验；若需保存，加入终浓度15%的甘油，-70℃保存。（二）转化（冰上操作）1、1.5mL管中加入感受态细胞50μL和待转化的质粒2μL，冰浴30min；2、42℃热击90sec（勿晃动管子）；3、冰浴2min；4、加入37℃预热的LB至1mL；5、37℃，振荡（50r/min）培养2h；6、取200μL涂板（Ampr），37℃培养12-16h；7、对生长出的白色菌落计数，计算出每微升质粒的转化率。六、实验作业1.计算出大肠杆菌的转化率，转化率=平板上的白色菌落数÷2μL。2.转化过程中，会不会出现假阳性的结果，为什么？如何排除？答：转化过程中，经常出现假阳性。原因很多，如质粒、菌株不纯，载体自连等。详细的解释见《分子遗传学》。