第六章：胚乳培养

第六章胚乳培养杨柏云南昌大学生命科学学院胚乳培养胚乳在被子植物中，大多数（超过81%）是双受精产物。当雄配子进入胚囊时，它由二个极核和一个雄配子融合而形成的胚乳核发育而成，所以在倍性上大多属于三倍体组织。胚乳又是供胚生长发育的营养仓库。或迟或早，胚乳都会被胚在发育时吸收而消耗掉。只有兰科、豆科、菱科及河苔草科植物，种子中不形成胚乳或几乎不形成胚乳，它们的营养存在子叶内。植物胚乳的发育特性植物胚乳可以分为两大类：被子植物胚乳和裸子植物胚乳。被子植物胚乳是双受精的产物，它由二个极核和一个雄配子融合形成，所以，在染色体倍性上它属于三倍体组织。裸子植物很特殊，它的胚乳在受精前就已形成。裸子植物的胚乳为配子体的一部分，由大孢子直接分裂发育而成，因此它是单倍体组织。植物胚乳的发育特性胚乳(endosperm)按发育初期是否形成细胞壁可分为三种类型：核型胚乳(nucleartype)胚乳最初发育经过一段游离核阶段，绝大多数被子植物的胚乳属于核型胚乳。游离核阶段时间长短因植物不同而异。植物胚乳的发育特性几种植物游离核时间比较植物类型形成细胞壁时的游离核数咖啡属4核还阳参属8核～16核小麦100核左右报春花、芒果、苹果、柑橘几百核左右植物胚乳的发育特性细胞型胚乳(cellulartype)和核型胚乳不同，细胞型胚乳的发育不经过游离核阶段而按正常的细胞分裂方式进行。胚乳初生核第一次分裂后即形成两个子细胞，以后每次分裂都形成细胞壁。某些合瓣花植物，如烟草、芝麻、以及番茄等是属于次类。植物胚乳的发育特性沼生目型胚乳(helobialtype)是核型与细胞型之间的中间型。初生胚乳核第一次分裂为细胞型，以后两个细胞中的核进行游离核分裂。胚乳培养研究热点1.胚乳细胞的全能性。在离体培养下，胚乳细胞是否与其他体细胞或花粉一样，具有全能性而再生成为植株。2.大多数被子植物的胚乳是三倍体的，能否通过胚乳培养获得三倍体植株并得到无籽结实；通过胚乳培养技术，探索改良农、林及园艺植物三倍体育种技术的可能性。3.研究离体下胚与胚乳的关系。胚乳培养中存在的问题到2006年，约有对60种植物的胚乳进行过培养。它们中有罗核氏木、苹果、柚、橙、檀香、猕猴桃、玉米、大麦、小黑麦、水稻、马铃薯、枸杞、锦丰梨、核桃等胚乳培养得到了再生植株。其余的或只有根、叶、芽的分化或仍只停留于愈伤组织等阶段。胚乳培养中存在的问题在获得了再生植株的种类中，只有猕猴桃、枸杞的试管苗已大量移栽成活并在大田开花结果，这是胚乳培养中从实验室走向大田生产的一个很大突破。它不但为胚乳培养技术用于育种提供了可能，也为胚乳培养再生植株的遗传学等的研究积累了丰富的资料。胚乳培养中存在的问题从染色体数目的分析表明，胚乳愈伤组织及胚乳植株染色体数目变化很大。如在苹果“金冠”和“红玉”的胚乳植株中，其根尖染色体数目分别为32～48和27～58左右，其中多于35条非整倍体细胞十分普遍。而直正三倍体的细胞却很少。在大麦的胚乳培养中根尖染色体数目可以从1到4倍，另外还有许多具6、8、11、12、13条染色体的非整倍体细胞。胚乳培养中存在的问题倍性的混乱，在胚乳培养中是较为普遍的现象。它们中，除了有三倍体和多倍体以外，多数是具多种倍性细胞所组成的嵌合体。这在希望从三倍体的胚乳诱导形成三倍体植物的设想方面又增加了新的障碍。胚乳培养中存在的问题但从体细胞无性系变异的角度出发，胚乳再生植株后代倍性的不一致性，可以产生出不同类型的非整倍体和各种多倍体株系，可为多倍体育种开辟了一条新的途径。胚乳培养中存在的问题此外，还可以从理论上探讨引起倍性混乱的原因及其控制的可能性，研究胚乳植株形态发生规律及其遗传性状变化问题以及胚和胚乳的关系等等。胚乳培养中应注意的问题1.确定适宜的发育时期胚乳的发育，大致可以分为早期、旺盛生长期和成熟期三个阶段。处于发育早期的胚乳，如核型胚乳的游核时期或刚刚形成细胞时期的胚乳，难于培养产生愈伤组织或形成器官。生长旺盛期的胚乳，大多是取材的最合适时期，以前培养成功的植物，大都是取这个时期的胚乳,如大麦、水稻、苹果、猕猴桃等。少数是取成熟时期的胚乳也能获得成功，如蓖麻、巴豆、麻风树、罗氏核实木等。胚乳培养中应注意的问题植物种类不同，胚乳生长旺盛阶段的日期也不会一样，此时的胚乳具有：胚已分化完成，胚乳已充分生长，几乎达到成熟时大小；外观为乳白色半透明的固体，且富有弹性等特点。在开始对任何一种植物进行胚乳培养时，除了要查阅有关文献外，还应事先按期采集和固定开花的材料作为系统观察，以确认该植物胚乳的发生类型和发育时期，为下一步深入工作打好基础。胚乳培养中应注意的问题不同的植物胚乳的最适宜取材日期是不同的，在单子叶植物中，百合是传粉后的9～10天，水稻是传粉后的5～7天，玉米是8～11天，小麦是8～11天，大麦是8天，小黑麦杂种胚乳是7～14天。在双子叶植物中，黄瓜是传粉后的7～10天，苹果为传粉后的30天，猕猴桃则要80天左右，梨、枸杞为未成熟胚乳，檀香为成熟胚乳。胚乳培养中应注意的问题总之，工作一开始，要认真对不同发育时期胚乳进行培养，筛选出一个最适宜于诱导及分化的胚乳取材时间是培养成功的保证。胚乳培养中应注意的问题2.严格区分胚乳与其他组织取胚乳接种时，由于胚乳包围着胚，如何绝对地使胚乳与胚分离而不带胚或包裹着胚的珠心、珠被组织，是保证实验正确性的重要环节。否则，在胚乳外植体中混入二倍体细胞或组织，它们增殖一般又较胚乳快，这样不但影响了胚乳的诱导和分化，而且常常会形成二倍体愈伤组织与胚乳愈伤组织混杂的局面。胚乳培养中应注意的问题为了保证获得纯净一致的胚乳外植体，在接种后3～4天内应及时观察、检查。把一些变绿（胚及胚的切碎部分，在培养早期容易出现色泽），或其它异样色泽的接种物除掉。但如果要进行胚在胚乳培养中作用的试验，则可将胚与胚乳放在同一培养基中培养并使胚与胚乳分开放置在不同的位置。胚乳培养中应注意的问题关于胚在胚乳培养中的作用问题，Bhojiwani(1966)在巴豆和罗氏核实木的研究中，认为胚乳培养中必须有胚存在，胚乳愈伤组织和体胚的产生以及增殖均依赖于胚在生长过程中产生的代谢产物（胚因素）来提供营养。在枸杞胚乳培养中，带胚的试验，均出现提高了胚乳愈伤组织诱导率的效果。但在小黑麦、水稻、大麦、苹果、马铃薯等的胚乳培养中，不带胚的胚乳培养，同样也可产生愈伤组织或分化出胚状体和芽。胚乳培养中应注意的问题3.合理使用植物激素植物激素的种类和浓度对胚乳愈伤组织的诱导和器官建成起着决定性的作用。在不加任何激素的培养基上，胚乳外植体很少或完全不能启动。不同植物的胚乳培养要求有不同的外源激素及合理的细胞分裂素与生长素的配比。如大麦胚乳愈伤组织产生和生长，2,4－D是必要的，柚胚乳植株的产生必须加入高浓度（15mg/L）赤霉素；胚乳培养中应注意的问题猕猴桃胚乳培养时，当玉米素3mg/L与2,4－D0.5mg/L配合时，产生胚性愈伤组织，并在1mg/L玉米素中分化出体细胞胚，如果玉米素3mg/L与NAA0.5mg/L配合，则不产生愈伤组织而是直接分化出叶状体，在低浓度玉米素1mg/L中产生芽。所以，植物激素的不同与浓度配比对胚乳愈伤组织的诱导及分化方向有着微妙的影响。胚乳培养中应注意的问题4.注意光、温及pH值的影响胚乳培养对温度的要求，一般在24～28℃之间，在玉米胚乳培养时，25℃时是玉米胚乳培养的最适温度，30℃时，生长比25℃至少减少了50%，20度时则下降了4倍。麻风树和蓖麻的胚乳则以24～26℃时生长最好。胚乳培养中应注意的问题对光线反应，不同植物也不同。玉米胚乳适于暗培养，蓖麻则在1500lx的连续光照下生长较好。而对黑麦草的胚乳愈伤组织，光照未显示出任何明显的影响。一般植物多用交替光照，即10～12h光照，14～12h黑暗条件下培养。胚乳培养中应注意的问题pH值的作用，一般胚乳培养中的pH值约在4.6～6.3之间，巴婆的胚乳愈伤组织以pH4.6～5.0时生长最好，蓖麻的pH值为5.0,麻风树和核实木的为5.6,玉米则要求7.0。操作实例1.猕猴桃胚乳的培养（1）材料的选择与培养在猕猴桃开花后约70～80天，取幼果于70%酒精中过一下，再用10%安替福民溶液灭菌10分钟。在无菌下切开幼果，取出种子放在培养皿内。在解剖镜下剥去种皮，这时可见胚乳呈乳白色，有弹性，用镊子或解剖针轻压胚乳的合点端，这时，白色、发育完全的胚就会从珠孔端挤出。剥离的胚乳外植体为中空的囊状物。操作实例将胚乳外植体分别接种在下列培养基上：（1）MS(2)MS＋玉米素1mg/L(3)MS＋玉米素3mg/L(4)MS+玉米素3mg/L+NAA0.5mg/L(5)MS+玉米素3mg/L+NAA0.5mg/L+CH400mg/L(6)MS＋玉米素3mg/L+2,4-ｄ0.5mg/L(7)MS＋玉米素3mg/L+2,4-ｄ0.5mg/L+CH400mg/L(8)MS+2,4-d1.0mg/L操作实例（2）愈伤组织的诱导及植株分化：接种后一周，仅在含有2,4－d的培养基上可产生白色愈伤组织，其余各组均无变化。大约培养15～20天，在含有玉米素、萘乙酸的2～5组，胚乳外植体表面出现瘤状突起，继之转绿，伸展成叶状体。如将产生的叶状体材料转接至(2)培养基上，即可分化出不定芽。对于产生愈伤组织的各组，大约在接种后15天转至（2）培养基上，其中（6）、（7）组的愈伤组织，在转移后15天，即可从愈伤组织内分化出胚状体并发育成完整植株。而仅含2,4－D的（8）组，则无任何器官分化。操作实例2.枸杞的胚乳培养（1）材料的选择与培养：采集宁夏枸杞健壮植株变色期的果实，把果实在70%酒精中消毒几秒钟，然后用0.1%氯化汞溶液消毒6分钟，无菌水冲洗3次。在培养皿内将果实切开，用镊子夹出种子，在解剖镜下剥去种皮并去掉胚，取胚乳接种到下面培养基上：MS＋2,4－D2.0mg/L+Kt0.5mg/L;MS＋2,4－D0.5mg/L。蔗糖浓度为5%，培养温度26度，光照时间10小时。（2）愈伤组织的诱导与植株分化：在上述培养基培养1周，胚乳外植体上已有愈伤组织产生。培养15～20天，愈伤组织已至蚕豆大小，淡黄色、松散，不易用镊子夹起。培养30天后统计，培养基（1）、（2）上的胚乳愈伤组织诱导率分别为37.3%和23.1%。再将愈伤组织转接到下面4种培养基上：操作实例A.MS+6-BA0.5mg/L;B.MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L;C.MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+GA2mg/L;D.MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+CH400mg/L;蔗糖均为2%。操作实例在转接10天后，A、B、C三组培养基上的愈伤组织明显长大，D组上的愈伤组织则无明显变化。但在培养15天后，上述4种培养基上的愈伤组织都有芽点分化，约20天后，芽开始分化并发育成具有明显茎、叶结构，根系发达的植株，有的为从生苗。操作实例培养1个月后的统计表明，上述4种培养基上的愈伤组织分化植株率分别为71.4%,85.7%,75.0%,40.0%。以B组的效果最好，特别是加了胳朊水解物的D组分化率最低，甚至愈伤组织变褐，逐渐死亡。操作实例当小苗长到4～5片叶，高2.0cm时，可从基部切断，放到IBA50mg/L的溶液中浸泡20～30分钟后，再扦插到无激素的MS培养基上，约10天即可长根。或转接到MS＋NAA0.1～0.5mg/L培养基上，也能长根。