第七章抗原抗体反应

第五节常见免疫分析方法凝集反应、沉淀反应、中和反应、补体参与的反应等。一、抗原抗体反应类型一）凝集反应：1、定义：颗粒性抗原与相应抗体相遇后，在电解质参与下出现肉眼可见凝集物的现象。2、参与要素：①凝聚原：参与凝聚反应的抗原，如：血细胞、菌体等。②凝聚素：参与凝聚反应的抗体。3、类型①直接凝集反应（定性实验，检测抗原或抗体）：颗粒性抗原与相应抗体在有电解质时，直接结合所出现的凝集现象。常用方法：A、玻片法：细菌及ABO血型鉴定（标准血清检测抗原）B、试管法：肥达氏反应（伤寒或副伤寒杆菌标准液检测血清）②间接凝集反应（检测可溶性抗原或抗体）：将可溶性抗原吸附于与免疫无关的小颗粒（载体）表面后，与相应的抗体在电解质存在的下而发生的凝集反应。常用载体颗粒：红细胞[人（O型）和动物（绵羊、兔鸡等）]、胶体颗粒、聚苯乙烯乳酸、活性碳等间接血细胞凝集试验：以红细胞作为载体的凝集反应。③凝集抑制实验将可溶性抗原与相应抗体预先作用，然后再加入致敏颗粒（吸附相同可溶性抗原的乳胶颗粒）,由于抗体已被可溶性抗原结合,因而致敏颗粒不发生凝集现象。如免疫妊娠实验测验尿中HCG（乳胶凝集抑制试验，无凝集者为阳性）。+不含待测抗原，产生凝集，但为阴性反应++含有待测抗原，不凝集，阳性反应Patient’ssample二）沉淀反应：1、定义：可溶性抗原与相应抗体在一定条件下，出现细微沉淀物的现象。2、参与因素：①沉淀原：参与沉淀反应的抗原。包括：蛋白质、多糖和类脂溶液、血清、细菌抽提液、组织浸出液等。②沉淀素：参与沉淀反应的抗体。3、类型：①环状沉淀反应：将已知抗原（抗体）注入特制小试管中，再沿管壁徐徐加入适量抗体（抗原），在两液界面出现白色的沉淀圆环的现象。②絮状沉淀反应：将已知抗原与抗体在试管内混匀后，出现肉眼可见的絮状沉淀的现象。③凝胶扩散试验：利用可溶性抗原、抗体在半固体琼脂内扩散，在其扩散的某一部分出现白色沉淀线的现象。凝胶扩散实验分为：单向琼脂扩散（定性、定量分析）双向琼脂扩散（定性分析）三）中和反应：抗体使相应抗原（毒素或病毒）的毒性或传染性丧失的反应。抗毒素：使相应毒素失去毒性的抗体。中和抗体：使相应病毒丧失传染性的抗体。中和反应应用：毒素或病毒种型的鉴定与抗原性分析；抗毒素或中和抗体的效价测定。四）补体参与的反应1、反应特点：抗原抗体复合物激活补体，被活化的补体成分可与抗原抗体复合物结合；补体被复合物结合后即被消耗。2、反应类型1）溶菌反应：某些革兰氏阳性菌，与相应抗体结合后，形成抗原抗体复合物，在加入补体，则出现的细菌溶解现象。2）溶血反应：红细胞与相应抗体特异性结合后，在有足量补体存在条件下，出现红细胞溶解的现象。3）补体结合反应：在补体参与下，并以绵羊红细胞和溶血素（抗绵羊红细胞的抗体）为指示系统的抗原抗体反应。3、补体结合反应系统：①检（待）测系统：待测的抗原+抗血清（抗体、补体）②指示系统：绵羊红细胞（抗原）+溶血素（抗体）③补体系统豚鼠的新鲜血清4、反应过程1、免疫分析的定义：利用抗原抗体的特异性反应的特性对抗原或抗体进行量和质的测定分析。二、常见免疫分析方法•特异性强•灵敏度高•反应速度快2、特点：补体结合阴性反应（－），无待测物抗原+抗血清+豚鼠新鲜血清检（待）测系统红细胞+溶血素指示系统溶血不溶血补体结合阳性反应（＋），含待测物补体系统一）免疫沉淀1、环状沉淀反应应用：抗原抗体的定性及定量分析。方法：试管法，玻片法常用已知抗体来检测未知抗原。定量实验时，由于抗原分子小，反应面积大，且为保证Ag与Ab的适宜比例，有足够的抗体参与反应，操作上通常是稀释抗原（上层），而不稀释抗体（下层）与图示相反2、凝胶扩散沉淀1）单向扩散法（Mancini法）：将抗血清均匀地混合于琼脂糖凝胶（浓度为：0.8~1%）内，倒平板，平板打孔，孔中加入待测的抗原样品，抗原呈辐射状向含抗体的胶内扩散，至抗原与抗体的量达一定比例时形成可见的沉淀环。一定条件下沉淀环的直径或面积与相应的抗原含量成正比。应用：定性与定量分析，常用于测定血清中IgG、IgM、IgA及补体的含量。2）双向扩散法（Ouchterlony法）：在琼脂糖凝胶平板内打两排孔，孔中分别加入抗原、抗体，抗原、抗体分别呈辐射状向含胶内扩散，当抗原与抗体在胶内相遇，且二者的量达一定比例时则形成可见的沉淀线。应用：①定性分析：鉴别抗原与抗体反应间的特异性如何：根据相邻孔中不同抗原与同一抗血清反应形成的沉淀线形状的变化判断抗原间是否存在共同的AD。②定量分析：测定抗血清效价及抗原的最佳浓度。定性分析两孔抗原完全融合互不干扰的交叉线向共同Ag方向突出同一血清与不同抗原反应双向免疫扩散定量分析：测定抗血清效价及抗原的最佳浓度抗原稀释度抗血清稀释度不稀释1/21/41/81/161/321/641/128不稀释＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋－－1/2＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋－－1/4＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋－－1/8＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋－－1/16＋＋＋＋＋＋＋＋＋－－1/32＋＋＋＋－－－－1/64＋＋＋＋－－－－表中＋～＋＋＋代表出现沉淀线的强度，如：1:8、1:16抗体出现中等浓度沉淀线，1:32出现较弱的沉淀线。抗血清的效价为最佳抗原浓度为：1:161:163、免疫电泳：利用蛋白质在凝胶中电泳移动速率不同而被分离的特性与免疫琼脂扩散结合起来的分析方法。2）特点：加快反应速度；提高免疫沉淀的灵敏度。3）免疫电泳的方法①血清免疫电泳1）原理：PH8.6时，混合蛋白抗原多数带负电，向正极移动（少数带正电的则向负极移动），不同抗原分子因大小及所带电荷不同，其电泳速度不一样而被分离。A、方法：抗原电泳抗体扩散形成沉淀线先将抗原进行电泳，分离成不同的区点（带）；在琼胶中沿电泳方向挖一平行小槽，加入抗血清，让抗原和抗体进行自由扩散，两者在合适的比例下形成沉淀弧。B、操作步骤：根据各蛋白所处的电泳位置，可分为：白蛋白区、球蛋白α1区、球蛋白α2区、球蛋白β区、球蛋白γ区沉淀弧可显示样品与对照血清蛋白组分的增加或减少情况正常血清待测抗原②对流免疫电泳（电渗析）：在电场的作用下，抗原、抗体进行相对运动，具有定向加速度的免疫双扩散技术。方法及原理：琼脂板上打两排孔，负极孔加待测抗原，正极孔内加相应抗体，通电后，带负电荷的抗原泳向正极抗体侧，而抗体（PH8.6时带负电）藉电渗作用流向负极抗原侧，在两者间形成沉淀线。（电渗：电场中液体对于固体支持物的相对移动）电泳力电渗力琼脂中含SO42-，带负电，其静电感应使附近水带正电，而向负极移动。电泳时有电泳力和电渗力两种力。若物质原来带正电，向负极移动，则因电渗作用向负极移动得更快。若物质向正极移动，所带电荷少，电泳力小于电渗力，也向负极移动，如：血清中的γ球蛋白抗原和抗体在电场中相向运动③火箭电泳：在电场的作用下，进行的免疫单向扩散技术。A、方法及原理：在含抗体的琼脂板负极端打一排抗原孔；加入抗原进行电泳，抗原泳向阳极，在抗原抗体比例恰当处发生结合沉淀。B、反应特点：随着泳动抗原的减少，沉淀逐渐减少，形成峰状的沉淀区，形状似火箭。抗体浓度保持不变，峰的高度与抗原量呈正比。抗体的量一定沉淀线高度与抗原量成正比二）免疫标记技术（一）放射免疫分析（RIA）：用放射性同位素标记的抗原或抗体，通过免疫反应来进行测定的技术，可进行抗原或抗体的定量分析。用放射性同位素、酶、荧光素等标记抗体或抗原等所进行的抗原抗体反应。常用方法有：放射免疫检测技术、免疫荧光技术、酶免疫技术等。特点：敏感度高、特异性强、快速，能进行定性、定量、定位检测1、常用来标记抗原或抗体的同位素：125I、131I、3H、35S1）125I，131I的标记—氯胺T法：氯胺T法标记原理：氯胺T是氯代酰胺类氧化剂，在水中不稳定，产生的氯离子将碘离子(I-)氧化为单质碘(I2)，单质碘与抗原或抗体分子上的苯丙氨酸及酪氨酸残基的苯环或组氨酸的咪唑基共价相连，使之发生碘化反应。125I，131I的标记—氯胺T法：2、标记方法标记Ag或Ab标记物纯化抗原抗体反应抗原抗体复合物沉淀测定其放射活性方法：电泳层析超速离心聚乙二醇沉淀分离液相用液体闪烁仪计数，固相用X射线胶片显影2）3H的标记—（N-琥珀酰亚胺[2，3-3H]丙酸酯）活泼酯基易和蛋白质的游离氨基反应。1）直接法：放射活性与抗体浓度呈正比Ag＊＋Ab（定量）Ag＊-Ab沉淀分离放射活性测定3、检测方法：直接法和竞争法2）竞争法：放射活性与待测抗原（未标记）浓度呈反比[Ag＊＋Ag]＋Ab定量待测限量Ag＊-Ab+Ag-Ab沉淀分离放射活性测定标记抗原与非标记抗原和特异抗体结合的能力相同抗原表位之和（标记+非标记的）多于特异性抗体的结合位点（抗原过量，抗体完全反应）。体外条件下，由非标记抗原（抗体）与定量的标记抗原（抗原）对限量的特异性抗体（抗原）的竞争性抑制的反应。放射性同位素标记分析法示意图抗原量一定，标记的抗体和非标记的抗体与抗原竞争结合，放射活性与待测抗体的量成反比放射活性与抗原量成正比反应特点：灵敏，精确不稳定安全性差（二）酶联免疫吸附试验（ELISA）将待测抗原或抗体吸附于固相表面（聚苯乙烯微量反应板），与酶标记的抗体或抗原反应后，加入底物反应（显色或发光）的分析方法。1、原理酶标板吸附抗原或抗体洗涤加入酶标抗体或抗原Ag-Ab酶或Ab-Ag酶加入酶作用底物显色反应2、用于标记的酶：碱性磷酸酶（AP）、辣根过氧化物酶（HRP）、脲酶、β-半乳糖苷酶等。•不同的酶催化的底物不同，显色产物吸收的波长不同。•有显色反应为正反应；无显色反应为负反应。•被检测的抗原或抗体的量与显色产物的量呈正比。3、方法（1）直接法（可检测抗原或抗体）：酶标板吸附抗原或抗体洗涤Ag－Ab酶或Ab－Ag酶显色反应Ab酶或Ag酶底物酶联免疫吸附试验——直接法（2）间接法（有两种抗体参与，一抗做反应桥梁）1Ab2Ab酶酶标板吸附抗原Ag－1Ab洗涤Ag－1Ab－2Ab酶底物显色反应酶联免疫吸附实验间接法一抗二抗酶标板吸附抗体AgAb-Ag洗涤Ab酶Ab-Ag-Ab酶底物显色反应（3）夹心法（不同抗体将抗原夹在中间反应）①直接夹心法②间接夹心法酶标板吸附抗体AgAb－Ag1AbAb－Ag－1Ab洗涤2Ab酶Ab－Ag－1Ab－2Ab酶底物显色反应酶联免疫吸附实验——夹心法（三）荧光与发光免疫分析用荧光素（异硫氰酸荧光素、藻红蛋白）或发光化合物标记抗体/抗原，再与吸附于固相表面的抗原/抗体反应，激发抗原抗体复合物发（荧）光，借此对抗原/抗体进行定性或定位。固相吸附抗原或抗体Ab光或Ag光Ab－Ag光或Ag－Ab光催化剂发光1、荧光免疫分析①标记物质：荧光素、3价稀土镧系元素铕离子(Eu3+)、铽离子（Tb3+）等。②常用方法：时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）借助波长（激发光与荧光波长区别较大）及时间（Eu3+荧光寿命长，待蛋白等发出的非特异荧光消失后再测）控制。④方法分类：直接法间接法直接夹心法间接夹心法⑤检测：用时间分辨荧光计检测荧光强度。③流程固相固定AgAbEu3+洗涤Ag-AbEu3+β二酮体增强液微胶囊340nm紫外光光613nm②生物发光：A、标记物质：虫荧素B、发光剂：虫荧酶+ATP+Mg2++O22、发光免疫分析（LIR）1）发光物质2）方法及原理：同ELISA。3）测定方法：用瞬时荧光仪测定其发光强度。①化学发光：A、标记物质：荧光醇、异荧光醇、吖啶酯等。B、催化剂：阳离子、酶、酸性条件+过氧化氢（四）亲和标记免疫分析利用金色葡萄球菌A蛋白与IgG的Fc段的高亲和力，用标记的葡萄球菌A蛋白（替代二抗）与抗体反应的分析方法。固相吸附AgIgGAg-IgG洗涤A蛋白＊Ag–IgG-A蛋白＊根据标记物质的类型采用适宜的检测方法1、标记葡萄球菌A蛋白分析方法利用被标记物质与检测物质间具有高度亲和力使两者进行特异性结合的分析方法。实验流程2、亲和素-生物素复合物分析法1）亲和素①来源：卵蛋白、链霉菌蛋白②特点：与生物素有很高的亲和力并进行特