几种低分子量有机酸磷酸对土壤胶体和矿物吸附酸性磷酸酶的影响

几种低分子量有机酸!磷酸对土壤胶体和矿物吸附酸性磷酸酶的影响赵振华黄巧云陈雯莉李学垣华中农业大学资源与环境学院华中农业大学教育部农业微生物重点实验室武汉摘要研究了有机酸根和磷酸根等配体体系中针铁矿!高岭石和黄棕壤!砖红壤胶体对酸性磷酸酶的吸附∀结果表明磷酸根对针铁矿表面酶的吸附量抑制最显著酒石酸根对酶与土壤胶体和高岭石表面酶的吸附量影响最强∀随着配体浓度增加乙酸根对酶吸附的影响表现为先促进∗#后轻微抑制#草酸则表现为先抑制∗#后促进∗#酒石酸和磷酸对酶的吸附表现为一直抑制∀在乙酸!草酸和低浓度的酒石酸和磷酸根体系中酶在土壤胶体和矿物表面的吸附等温线符合∏方程型高浓度的酒石酸和磷酸对应的吸附等温线符合线性方程≤型∀在酒石酸根和磷酸根体系中配体与酶加入顺序对酶吸附的影响较大一般来说配体和酶同时进入体系具有最低的酶吸附量∀关键词酸性磷酸酶土壤胶体矿物吸附有机酸磷酸∞≥√2∏2°°≥≤2∏±2∏≤∞•2÷∏2∏(ΦαχυλτψοφΡεσουρχεσανδΕνϖιρονμεντ;ΗυαζηονγΑγριχυλτυραλΥνιϖερσιτψ/ΚεψΛαβορατορψοφΑγρομιχροβιολογψ,ΜινιστρψοφΕδυχατιον,Ωυηαν430070)∏×∏2√•2∏√#∏∏∏##¬2∏∏∏×∏√∏2¬∏∏∏•∏≤×∏22∏∏∏∏≥°收稿日期22基金项目教育部优秀青年教师资助计划作者简介赵振华2男山西运城人在读博士生主要从事土壤环境生物化学方面的研究工作∀∞2∏∀黄巧云为通讯作者×2∞2∏∏∏土壤胶体表面阴离子的吸附以及它们与各种有机!无机离子及分子的相互作用对营养及污染元中国农业科学≥∏∏≥素的迁移和生物有效性有显著影响≈∗∀土壤体系中特别是土2根界面的微域环境微生物过程和根系分泌物产生的低分子量有机酸数量众多≈∀它们可在胶体表面发生吸附和配位交换作用促进多种养分离子和污染元素的有效化∀最近•等和⁄等观察到低分子量有机酸与亚硒酸或硫酸在铝氧化物上对吸附点位的竞争能力依赖于有机酸的浓度和结构≈∀土壤酶和蛋白质等生物大分子在一定程度上决定着土壤的生物活性∀土壤中的一部分胞外酶游离于土壤溶液中另一部分则通过物理或化学的方式键合到矿物!腐殖质或有机2矿物复合体表面≈∀酶在各种层状硅酸盐矿物和氧化物表面的吸附固定研究已有不少的报道≈∗∀许多结果表明酶的吸附导致酶活性一定程度的降低≈∀而且酶的吸附还受到体系中共存配体的影响如等发现酪氨酸酶在÷蒙脱石上的吸附量由于磷酸的存在而明显减少表明磷酸和酶分子在矿物表面有强烈的竞争作用≈∀然而有关各种有机和无机配体如有机酸和磷酸盐等对土壤胶体表面酶吸附影响的特点仍不清楚∀本文选取在土壤磷素循环中扮演重要角色的酸性磷酸酶比较了几种低分子量有机酸和磷酸对中南地区种代表性的土壤胶体!针铁矿和高岭石表面吸附磷酸酶的影响为阐明土壤酶存在状态和影响土壤酶活性的有关因素提高土壤质量提供科学依据∀1材料与方法11酶试剂酸性磷酸酶∞≤×#提取自甜马铃薯购于≥公司∀12土壤胶体和粘粒矿物制备供试土壤为湖北孝感±母质发育的黄棕壤∗和海南东山峙花岗岩发育的砖红壤∗高岭石为化学试剂∀将以上土壤和矿物制成悬浊液后用#将其调至中性超声波分散沉降法分离出小于Λ粘粒∀用#≤≤絮凝去离子水和酒精洗至#的检测不出≤ε下烘干过目筛∀针铁矿按的方法合成将含有ƒ#的溶液在电动搅拌下缓慢地加入#的溶液至为然后在ε下老化用砂芯漏斗抽滤的溶液洗涤沉淀ε下干燥过目筛≈∀制备的土壤胶体和矿物的主要性状列于表∀表1土壤胶体和粘土矿物的某些基本性质×≥土壤胶体或矿物≥有机质#⁄≤提取铁¬⁄≤#比表面≥∏#电荷零点°≤粘粒矿物组成≤高岭石高岭石针铁矿针铁矿黄棕壤≠伊利石矿物高岭石砖红壤高岭石伊利石和三水铝石微量粘粒矿物组成由÷2射线衍射分析有机质!电荷零点!游离铁!比表面测定分别采用重铬酸钾法电位滴定法法!⁄≤提取法乙二醇乙醚法测定≤÷2°≤∏2√∏¬∏⁄≤¬∏13土壤胶体和粘土矿物悬浊液制备称土壤胶体于锥形瓶中加适量去离子水以#盐酸或氢氧化钠不断地调悬浊液的直至稳定在约需周加滴甲苯杀菌定容至∀14供试配体体系中土壤胶体矿物对酸性磷酸酶的吸附为了研究配体和酶加入顺序对酶吸附的影响分别进行了以下种试验配体和酶同时加入试验∞在磁力搅拌下吸取土壤悬浊液于离心管中分别加入的酶溶液∗Λ#和配体溶液∗#各中国农业科学卷ε下振荡∀配体先于酶加入试验∞吸取土壤悬浊液和系列浓度配体溶液于离心管中ε下振荡再分别加入的配体溶液和Λ#的酶溶液继续振荡∀酶先于配体加入试验∞步骤与相同只是将酶溶液与配体溶液的加入顺序交换∀将上述振荡好的反应混合液静置≅下离心上清液中酶含量用ƒ2酚试剂法测定各体系中加入酶的总量扣除上清液中的酶量即为土壤胶体和粘粒矿物对酶的吸附量Λ#∀15酸性磷酸酶含量Λ的测定ƒ2酚试剂法吸取含∗Λ#的酶溶液于玻璃试管中加ƒ试剂甲摇匀室温下放置加入的ƒ试剂乙立即混匀于ε水浴中恒温以不含酶的试剂空白作对照在∂≥2型分光光度计上比色测定测定波长为∀2结果与讨论21配体浓度变化对酶在土壤胶体和矿物上吸附的影响由图可见供试的土壤胶体和矿物对酸性磷酸酶的吸附量随着有机或无机阴离子浓度的变化而变化∀当乙酸浓度从增加到#时针铁矿!高岭石和种土壤胶体对酶的吸附量逐渐增加当乙酸浓度超过#时酶的吸附量逐渐减少到低于或与对照相当的水平∀草酸体系中在∗#的草酸浓度范围内针铁矿对酶的吸附量随草酸浓度的增加而轻微减少就黄棕壤!砖红壤和高岭石而言草酸根从增加到#时酶的吸附量急剧降低超过#后酶的吸附量逐渐增加∀在酒石酸体系中随酒石酸浓度升高酶在针铁矿表面的吸附量一直下降而种土壤胶体和高岭石对酶的吸附量则呈先急剧下降∗#后逐渐稳定∗#的趋势∀磷酸体系中随着磷酸浓度的升高∗#种土壤胶体和矿物对酶的吸附量以较快的速度降低针铁矿对磷酸酶的吸附百分率可从对照的下降到#时的种土壤胶体和其它矿物对酶的吸附百分率则从下降到∗∀这些结果表明供试的有机!无机阴离子对酶在土壤胶体和矿物上的吸附影响呈现出不同的模式∀乙酸在较低浓度时可促进酶的吸附而草酸!酒石酸和磷酸的影响却与此相反∀在较低浓度时草酸和酒石酸对酶吸附的抑制比较明显磷酸对酶吸附的抑制作用则出现在较宽的浓度范围∀浓度较高时乙酸!酒石酸和磷酸体系中的酶吸附量呈现下降趋势而草酸却与此相反∀因此就针铁矿而言供试各有机!无机阴离子对酶吸附的抑制能力为磷酸酒石酸草酸乙酸而各配体对其它土壤胶体和高岭石上酶吸附的抑制能力则为酒石酸磷酸草酸乙酸∀图1配体浓度变化时酸性磷酸酶在不同土壤胶本和矿物上的吸附ƒ期赵振华等几种低分子量有机酸!磷酸对土壤胶体和矿物吸附酸性磷酸酶的影响阴离子之间的竞争作用可通过对表面吸附点位的直接竞争或者通过对表面电荷的改变或质子化影响来实现≈∀在铝氧化物表面•和∏2观察到了乙酸对≥和≥吸附的促进作用≈其原因可能是乙酸引起了有利于阴离子共吸附的表面质子化或电荷的变化∀可能的反应式如下ƒ≤≤ƒ≤≤≈ƒƒ酶分子可与质子化点位通过外圈复合物吸附在矿物的表面也可与矿物表面的≥2基团发生交换反应以内圈复合物进行吸附∀电泳数据显示在乙酸存在时铝氧化物表面具有更多的正电荷从而促进了≥和≥在铝氧化物上的吸附≈∀等还报道了乙酸可促进蒙脱石对磷酸的吸附∀在较高浓度#时乙酸对酶吸附的促进作用减弱可能归因于总的阴离子吸附密度的增加所导致的立体位阻和强烈的竞争作用≈∀草酸!酒石酸和磷酸在土壤胶体和矿物表面与酶分子的竞争作用和通常所观察到的无机含氧阴离子与酶的竞争吸附相一致≈∀一般认为有机阴离子的吸附亲和力和竞争能力与相应的Β型2有机配体复合物2的稳定常数有关∀如2值越大有机阴离子的吸附就越牢固有机阴离子与吸附在铝氧化物上的≥和≥竞争吸附就越有效≈∀本文的结果显示有机酸抑制酶吸附的相对能力为酒石酸草酸乙酸∀然而2和ƒ2的值均为草酸酒石酸乙酸≈∀这可能与较小分子量的有机阴离子和较大分子量的酶分子酸性磷酸酶的分子量约为⁄≈之间的巨大差异有关∀酶在矿物和有机表面的吸附机理通常包括配位交换≈!静电力!疏水力!氢键和∂•力等≈∀尽管酒石酸具有较小的2值但酒石酸比草酸具有更大的表面覆盖度其立体位阻在抑制矿物表面特别是层状硅酸盐矿物表面酶的吸附中作用更显著∀配体对酶吸附的抑制效率可通过以下公式来计算配体抑制效率有配体时酶的吸附量无配体时酶的吸附量∀对针铁矿而言当配体酶的摩尔比从升高到∗#配体浓度时磷酸根抑制酶吸附的效率从增加到酒石酸则从升高到而草酸的效率∀在种土壤胶体和高岭石体系中磷酸根的抑制效率与酒石酸和草酸的效率相似特别在配体浓度较低时∀众所周知针铁矿表面有大量的可供配位交换的吸附点位这些点位对磷酸和酶分子可能是通用的≈∀高岭石和种土壤胶体主要由层状铝硅酸盐矿物组成这类胶体表面配位交换点位较少酶可能主要以物理引力和疏水力等方式吸附在胶体表面因此磷酸根对这类表面上酶的吸附影响明显比针铁矿的低∀22酶的等温吸附曲线在乙酸!草酸和低浓度的酒石酸和磷酸体系中酶在土壤胶体和矿物表面的吸附等温线符合2∏方程型∀而高浓度的酒石酸#和磷酸#体系中所对应的酶的吸附等温线却符合线性方程∀图显示了在#的配体浓度的体系中供试土壤胶体和矿物表面对酶的吸附等温线∀酶吸附的∏参数根据下面公式计算ΞΞ≤≤∀其中Ξ是酶的理论最大吸附量≤是平衡溶液中酶的浓度是与吸附结合能有关的常数∀值越大表明酶分子和胶体矿物表面的吸附亲和力就越低∀由表中的数据可见不同阴离子体系中酶对针铁矿的亲和力高低顺序为乙酸草酸酒石酸磷酸∀就高岭石和种土壤胶体而言不同体系中酶与固相表面的亲和力为乙酸草酸磷酸酒石酸∀这意味着在有机或无机阴离子存在时酶对土壤胶体和矿物的亲和力随着配体和表面类型的变化而变化∀磷酸根显著降低了铁氧化物表面对酶的吸附亲和力酒石酸则对高岭石和以层状硅酸盐矿物为主的土壤胶体表面酶的吸附亲和力影响较大∀这与有机和无机配体体系中酶在土壤胶体和矿物上的吸附量的结果相一致∀除酒石酸外各阴离子体系中酶对针铁矿的亲和力顺序与配体本身对氧化物表面的亲和力顺序正好相反≈∀一般认为磷酸根对铁氧化物具有极强的亲和力这是导致酶在针铁矿表面的吸附亲和力较低的主要原因∀°等报道尽管磷酸和草酸都可以双核形态吸附在矿物的表面但它们被吸附的数量截然不同针铁矿表面所有的2型羟基可被磷酸的双核种类所取代而草酸的双核复合物仅能取代部分的2型羟基剩下的2型羟基将由吸附亲和力相对较弱的草酸单核复合物所取代≈∀酒石酸根降低酶与土壤胶体和高岭石表面亲和力的作用可能主要归因于其较大的分子量及其立体位阻效应∀中国农业科学卷图250#−1配体溶液中酸性磷酸酶在土壤胶体和矿物表面的等温吸附曲线ƒ#表2土壤胶体!矿物等温吸附酸性磷酸酶拟合∏方程的有关参数×∏土壤胶体和矿物≥参数°配体乙酸草酸¬酒石酸×磷酸°针铁矿÷¬∞∞黄棕壤≠÷¬高岭石÷¬砖红壤÷¬23阴离子加入顺序对酶吸附量的影响配体加入方式对酶吸附的影响随着配体类型的变化而变化图图∀对乙酸和草酸而言配体和酶同时进入体系∞处理!配体先于酶进入体系∞处理以及配体后于酶进入体系∞处理等几种处理对酶吸附量的影响差异不大∀这可能意味着吸附竞争力相对弱的配体加入顺序对酶在土壤组分上的吸附影响不大∀酒石酸和磷酸体系中∞处理通常具有最大的吸附量而∞处理则具有最小的酶吸附量这表明当酶和配体同时加入时二者之间存在更多的竞争∀酒石酸和磷酸的加入顺序对酶在高岭石表面吸附影响相对较小这与高岭石具有较少的供酶进行配位交换吸附点位有关∀3结论综上所述乙酸在较低浓度时促进了酶的吸附草酸对酶的吸附表现为先抑制后促进的趋势酒石酸和磷酸却随着其浓度的升高而显著抑制酶的吸附∀乙酸根促进酶吸附的作用可能与其在矿物表面的质子化过程有关∀磷酸根显著降低了酶与针铁矿的吸附亲和力酒石酸则对酶在土壤胶体和高岭石表面的吸附亲和力的影响最大表明配体分子大小在抑制矿物对酶的吸附中起重要作用∀当酶和配体一起加入或酶后于配体加入时酶的吸附量最低∀期赵振华等几种低分子量有机酸!磷酸对土壤胶体和矿物吸附酸性磷酸酶的影响图3草酸加入顺序对在土壤胶体和矿物表面酶吸附量的影响ƒ∞¬图4酒石酸