实验四(研究生)

实验中心RPMI-1640培养液的配制1.量取约700ml超纯水，倒入1L烧杯。2.分别称取3gHepes、2.4gNaHCO3，加入上述烧杯。3.剪开一包1640干粉培养基倒入上述液体并用超纯水洗包装袋内部二次，洗液全部移入容器内。4.容器口用原包装封口，室温磁力搅拌溶解，不要加热。5.定容至1000ml。6.过滤除菌。实验中心实验四细胞培养常用液生物技术学院陈白虹2011.11.29实验中心实验目的1.了解动物细胞培养所需的常用液。2.掌握细胞培养实验用水的制备。3.重点掌握RPMI-1640培养液的配制及操作要求。实验中心细胞培养常用液平衡盐溶液基本试剂培养液PBS、Hanks等消化液、抗生素等DMEM、1640等实验中心细胞培养实验用水的制备根据临床试验标准国际委员会（NCCLS）标准，将水质分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级和特殊用水。•Ⅰ级水：测试用时要求最小的干扰物和最大的纯度和精度，如原子吸收、痕量元素分析等。•Ⅱ级水：测试用时有可容忍的细菌存在，例如，不用保存的一般试剂的制备等。•Ⅲ级水：一般洗刷用水，制备高纯度纯水用水，配制微生物培养基用水等。•特殊用水：操作过程中要求除去特殊的污染物，例如组织/细胞培养中除去热源，HPLC中除去痕量有机物等。实验中心中国实验室用水国家标准GB6682-2000名称一级二级三级PH值范围（25℃）--5.0-7.5电导率（25℃）,mS/m≤0.010.100.50比电阻（MΩ.cm.25℃）≥1010.2可氧化物质[以（0）计]，mg/L-0.080.40吸光度（254nm,1cm光程）≤0.0010.01-蒸发残渣（105±2℃），mg/L≤-1.02.0可容性硅[以（sio2）计]，mg/L0.010.02-实验中心水中的污染物气体微生物离子HHH-C-C-OHHH有机物颗粒实验中心自动双重纯水蒸馏器•制水前先通电、通水，制水过程需实验人员看护以防止停水导致蒸馏水器损坏。•使用380V电源，安全性能差，耗电量大，运行成本高。•一次蒸馏水质难以满足实验要求，二、三次蒸馏，能源浪费极大，制水过程麻烦。实验中心制备超纯水的复合纯化技术预处理单元精纯化单元(Milli-Q)水箱自来水超滤柱UV254nm连续电去离子(EDI)Ultrapurewater预过滤柱反渗透离子交换树脂+活性碳UV254nmTOCTOC检测器电阻率检测器UV185/254nm实验中心实验中心纯水的应用•水质:电阻率10MW.cmTOC30ppb•纯水应用特点：对离子纯度有一定要求，但有机杂质的要求并不严格。–滴定–pH缓冲溶液–玻璃容器清洗–UV光谱分析–植物细胞培养–灭菌锅供水–超纯水供水实验中心超纯水的应用•水质：电阻率18.2MW.cm@25℃,TOC10ppb，微生物1cfu/ml。•超纯水应用特点：对离子纯度、有机物、微生物、颗粒均有严格要求。–精密仪器分析–分子生物学实验–细胞学实验•超纯水的使用习惯：–现取现用–电阻率只反应离子含量，与无机物含量无关–尽量避免纯水系统中有菌膜形成实验中心细胞培养基的定义人工模拟细胞体内生长环境，维持细胞生存和促进细胞生长增殖的营养物质。实验中心细胞培养基的种类和组成⒈天然培养基是使用最早的培养基，主要取自于动物体液或从动物组织分离提取，包括动物血浆、胚胎浸出液、血清、羊水、腹水等。优点:营养成分丰富、培养效果良好。缺点:成分复杂、个体差异大、来源有限。实验中心⒉合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学成分和数量完全了解的物质经过反复实验筛选、组合后形成的培养基。常用的合成培养基有MEM、DMEM、199、RPMI-1640等，其主要成分为：氨基酸、维生素、糖类、无机盐和添加动物血清。具有成分精确，重复性强，便于控制和标准化。实验中心⒊无血清培养基主要成分有：⑴生长因子和激素⑵结合蛋白⑶贴附因子和伸展因子⑷有利细胞生长的因子和元素实验中心RPMI-1640培养基的配制1.溶解培养基：将1包干粉培养基溶于总量2/3的水中，再用少量水洗包装袋内面两次，倒入培养液中，搅拌3-4小时。2.补加试剂：根据包装袋说明和试验需要加入NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等其他试剂。3.调pH值：加水到900ml，然后用5％NaHCO3调节pH到7.2，加水至终体积1000ml。4.过滤除菌：采用0.45和0.22µm滤膜各一张，上层为0.45、下层为0.22µm，以保证过滤效果。注意滤膜正面（光面）朝上。过滤后分装于小瓶中（250ml），4℃保存。实验中心调节流速控制压力串珠状膜的完整性实验中心注意事项●认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。●配制时要保证充分溶解。●配制培养基最好使用新制备的三蒸水或超纯水。一般在试验前当天或前一天制备为好。调节pH值的酸碱溶液也应该使用这种水配制。实验中心●制备培养基的器皿清洗要绝对干净，烤干后备用（滤器、滤膜、量筒、移液管及盛放培养基的小瓶等存放和转移培养基液体的器具都应进行灭菌）。●搅拌时容器口应用锡纸封口，配好后应马上过滤。●培养液过滤后，要先抽取少许放入培养瓶内在37℃温箱内放置72小时，以检测培养液是否有污染。●4℃保存6-9个月(不含谷氨酰胺)或2-3周(含谷氨酰胺、血清或抗生素)实验中心血清牛血清的主要作用⑴提供生长因子和激素⑵提供贴附因子和伸展因子⑶提供结合蛋白⑷提供必需脂肪酸和微量元素实验中心牛血清质量要求胎牛血清新生牛血清小牛血清牛龄8月龄胎牛12-24小时3个月血清收集心脏穿刺静脉放血静脉放血无菌---病毒---支原体---噬菌体---内毒素(ng/ml)≤1≤10≤10(15)血红蛋白(g%)3.0-4.53.5-6.05.0-8.5pH6.7-8.07.0-8.07.8-8.0渗透压(mom/KgH2o)240-340240-340240-340实验中心牛血清的筛选1.细胞培养法20%不同批号血清的培养液培养同一细胞数的细胞，连续传三代，若细胞生长良好，再将血清浓度降至10%或更低继续传代，由此可确定所试血清是否适合于该细胞的培养及所需的最低浓度。2.克隆化法20%不同批号血清的培养液分别对同一株杂交瘤细胞以有限稀释法进行克隆化，5-7天镜下观察细胞克隆生长情况，一般好血清可使70%以上的孔长出克隆，且生长迅速、细胞圆亮、胞浆丰满。实验中心黑胶虫实验中心平衡盐溶液（balancedsaltsolution,BSS）主要是由无机盐、葡萄糖组成。无机离子是细胞的重要成分，它的作用是维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定；葡萄糖提供细胞生存所需的能量。平衡盐溶液是人工合成培养基的基础用液，又常用来洗涤细胞，配好的平衡盐溶液可以通过过滤除菌或高压灭菌。实验中心PBS（Phosphate-BufferedSallines）KCl0.2gNaCl8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4·2H2O1.56gH2O1000ml实验中心实验中心消化液（0.25%胰酶+0.02%EDTA）将0.25g胰酶、0.02gEDTA加入100mlD-Hanks液或PBS（无Ca2+、Mg2+)中，一边滴加1NNaOH一边搅拌，作用是促进溶解和调pH值至7.2-7.4。完全溶解后，过滤除菌，4℃备用。实验中心谷氨酰胺补充液谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4℃下放置7天即可分解约50%，所以在4℃放置2周以上时，要重新加入谷氨酰胺使其终浓度为0.002mol/L。100×贮存液：称取2.92gL-谷氨酰胺，用三蒸水或超纯水溶解至100ml，过滤除菌，分装小瓶,-20℃冻存。实验中心pH调整液NaHCO3溶液常用浓度为7.5%。称取7.5gNaHCO3，用三蒸水或超纯水溶解至100ml，过滤除菌，分装小瓶，4℃冻存。HEPES[N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-乙基磺酸]溶液主要作用:防止培养基pH迅速变动。在观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时pH可以维持在7.0左右。使用终浓度一般为10-50mmol/L。1M储存液：用20ml双蒸水溶解4.76gHEPES，过滤除菌，分装小瓶，4℃保存。实验中心双抗溶液1000×双抗贮存液：各取100万U(0.6g)青霉素、100万U(1g)链霉素(Sigma公司)溶于10ml三蒸水或超纯水中，过滤除菌，分装小瓶,-20℃冻存。使用时，在培养基中按1:1000稀释，即终浓度为青霉素和链霉素各100U/ml。实验中心