04-- 基因的精细结构

湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnology湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnology第四章基因精细结构的遗传分析湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnologySect1基因的概念湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnology（一）遗传因子孟德尔的遗传因子是基因的最初概念，认为生物性状的遗传是遗传因子所控制的。性状本身是不能遗传的，控制性状的遗传因子才是遗传的。一、基因的概念的发展（二）基因1909年丹麦遗传学家Johannsen提出了“gene”这一名词，用以代替孟德尔的遗传因子。基因是决定遗传性状的基本的遗传单位。人们只能从基因所起的作用或它所产生的遗传效果来认识基因的存在和功能及其遗传传递规律。湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnology（三）染色体是基因的载体1903年,Sutton和Boveri提出了染色体遗传学说，认为基因由染色体携带着的，即染色体是基因的载体学说，并推测到每一条染色体上具有许多个基因。这个学说被美国遗传学家Morgen等人于1910年前后证明。湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnology1926年，Morgen出版了《Thetheoryofthegene》使人们对基因有了一个比较全面的理性认识，归纳出基因具有的特性：基因的特性2、基因的是一种能产生特定的表型效应的功能单位，即基因具有控制生物性状的形成的功能。1、基因是一种能自我复制的稳定的遗传结构单位，认为基因是遗传的最小的基本单位；交换和重组只能发生在基因之间，而不能在它们之中，即认为基因是不可分的。湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnology3、基因是一种突变单位，基因在遗传的同时又表现出变异，基因可以从一个等位形式变为另一等位形式，但在基因内部没有可以改变的更小单位。4、染色体是基因的载体，基因以线性方式排列在染色体上，同源染色体上的等位基因可以彼此分离；同一对同源染色体上的非等位基因连锁互换；而不同的同源染色体的非等位基因自由组合，从而表现出基因遗传的三大规律。湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnology早期对于染色体的生物化学分析表明：染色体的主要化学成份是脱氧核糖核酸（DNA——Deoxyribonucleicacid）和蛋白质，由此导致遗传学界广泛而持之地争论。DNA还是蛋白质为遗传物质？直到1944年这场争论才告一段落，但并没有结束。二、DNA（orRNA）是遗传物质湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnology（1）DNA通常只在细胞核中的染色体上找到，线粒体和叶绿体等有它们自己的DNA（半自主细胞器）。（2）一种生物，不论年龄大小，不论身体的那一种组织，在一定的条件下，每个细胞核的DNA含量基本上是相同的，而精子的DNA含量正好是体细胞的一半，蛋白质其他化学成分不符合这种情况。（3）一种生物的各种细胞中，DNA在量上恒定，在质上也是恒定的。（4）各类生物中，能改变DNA结构的化学物质可引起突变。（一）间接证据湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnology（1）T2phage感染实验（Hershey,1952）证明DAN是遗传物质。（二）直接证据：主要是来自微生物遗传学实验的证据（2）TMV(烟草花叶病毒)的重建试验：1956年，FraenketConrat用TMV做了一个实验。证明在只有RNA而不具有DNA的病毒中，RNA是遗传物质。（3）肺炎球菌的转化：1928年，Griffith(英国医生)发现肺炎球菌的转化现象。湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnology（2）TMV(烟草花叶病毒)的重建试验湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnology（3）肺炎球菌的转化湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnology1944年，O．T．Avery和他的小组经过十年工作证明细菌毒性转化是由DNA引起的，即证明遗传物质是DNA。1964年,FoxAllen在肺炎双球菌中，Bodmer,Ganesen在枯草杆菌中，用同位素标记供体DNA进行转化实验，进一步证实了Avery的工作。化学家，物理学家纷纷加入到生物大分子DNA的化学结构及其遗传功能的深入研究。湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnology1953年，J.D.Watson&F.H.C.Crick根据（1）英国皇家科学院生物理学家MauriceWilkinsandRosalindFranklin(女)的X—射线对DNA结晶的衍射试验结果（推测DNA分子是细长的，由两条链组成的互相平行的结构）DNA分子双螺旋结构的模型（2）美国生物化学家ErwinChargalf(1951)关于核酸DNA的碱基互补配对原则。Watson&Crick提出了关于DNA分子双螺旋结构的模型。因此华生，克里克和威尔金斯获得了1962年诺贝尔化学奖。湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnology湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnology湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnology湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnology湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnology通过对DNA双螺旋的研究，人们逐步认识到DNA作为遗传物质的特征：（1）遗传物质的自我复制（2）遗传物质的功能（3）遗传物质的多样性（4）遗传物质的变异性（5）遗传物质的恒定性（6）遗传物质的遗传传递规律。遗传物质的特征湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnology1957年，Crick提出遗传信息在细胞内的传递的基本法则：遗传信息是由DNA传向DNA，或由DAN传向RNA，然后决定蛋白质的特异性；但遗传信息不能由蛋白质传向DNA或RNA。（三）中心法则：湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnology（1）基因的自我复制：细胞分裂时，从一个等位基因复制到全同的两个基因，在分子水平上来说是DNA分子自体复制，从一个DNA分子半保留复制成分两个完全相同的两个DNA分子。（2）基因决定性状：DNA分子异性催化时，某一区段的核酸顺序互补地决定mRNA的核酸顺序、转而专一性决定蛋白质的氨基酸顺序；某一基因存在时，决定某种酶或蛋白质的合成，从而通过生理生化过程，表现某一性状。中心法则从根本上解释了DNA是遗传物质的基本问题，并从分子水平上解释了基因的三个基本特征：湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnology（3）基因的突变：DNA分子很稳定，但偶尔也会出现差错，例如某一过程内一个核酸对改变了，改变了的新核酸顺序通过复制又能稳定保持下去。基因也很稳定，但偶尔也会发生突变，出现一个跟原来的基因不同的新的等位基因，这个基因通过自体复制又稳定地一代代传下去。各类生物中，能改变DNA结构的化学物质可引起突变。湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnology知道了DNA是遗传物质，那么基因和DNA之间关系怎样呢？三、基因和DNADNA分子最短的约有4000bp，最长40亿bp多数肽链由150‾300氨基酸组成。对应的DNA片段450-900bp；E.coli裸露的DNA分子有500万bp，包含有7500个基因，那么，每个基因包含有600‾700bp生化分析表明：染色体复制后经过分裂成为染色单体，染色单体上含有一个双链DNA分子。遗传学告诉我们：一个染色体上有许多基因组成基因连锁群，那么一个基因就相当于DNA上一个特定的有功能的片段。湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnology怎样判断DNA分子中某一段核酸序列是有某个基因呢？方法之一就是测定某一段DNA的核苷酸序列和相应产物的序列。1965年Holley等第一次测出了酵母菌丙aa-tRNA的75个核苷酸序列；1972年Fiers测定了RNAMS2Phage外壳蛋白质基因的核苷酸序列：3569bp；1978年完成了整个RNA全序列测定，并与对应的肽链蛋白的氨基酸序列完全对应起来。1977年Sanger等完全了φХ174的5386个bp的全序列测定。这些工作使人们对基因的本质以及基因与DNA之间的关系有了更深入的理解。湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnology（1）DNA的变性与复性DNA的变性：双链DNA在中性盐液中加热，或经变性剂处理，两条多核苷酸链分开成为两条单链的特性称为DNA变性（Denaturation）DNA的复性：变性后成为单链的DNA，在适当条件一又能回复成为双链DNA叫做复性（renaturation或退火annealing）。(一）基因测序技术简介利用DNA分子的这一特性，可以制备单链DNA，进行核酸分子杂交，测定异源双链的同源性（也就是碱基序列间的相似性）以及估算GC碱基对在DNA链中所占的比例等，进行DNA碱基序列的测定。湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnologya、破碎或消化组织（细胞壁）释放出细胞内容物b、破坏细胞膜使DNA释放到提取缓冲液，得粗提物c、粗提物分离DNA①通过氯仿或苯酚处理后蛋白质变性沉淀去除②通过RnaseA处理除去RNA③通过CTAB沉淀将DNA和多糖分离④2%w/v聚乙烯吡咯烷酮（PVP）除去多酚类杂质d、DNA提纯与质量检测（2）提取DNA的一般程序和原理湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnology湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnology（3）DNA分子杂交：利用DNA的变性与复性的特性，可以进行DNA分子杂交，即让一些具有彼此互补的碱基顺序（同源的或非同源的）的单链核苷酸（DNA或RNA）混合在一起保温退火，单链之间即可以互补形成双链（ssDNA—ssDNA，ssDNA—RNA，RNA—RNA）用途：测定两种未知的DNA之间，以及DNA与RNA之间的关系,进行基因的同源比较、寻找基因、基因测序、制备分子探针、基因工程等许多方面的研究。湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnologyb.标记材料：用来杂交的材料一般都用放射性3H，14C或32P进行标记（或用地高莘或生物素萤光标记）核酸杂交的原理a.首先制备长的多核苷酸单链，并使其固相化：固定在琼脂或硝化纤维膜上，固定的目的是防止单链中可能有的同源自身配对形成折迭。c.当被固定的DNA接触放射性的片段时，同源的部分便可以通过H键结合起来，把没有能和固相化的长核苷酸结合的片段洗掉，剩下来的双链分子就是杂交DNA分子。湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnology湖南科技大学HunanUniversityofScienceandTechnology（a）通过分子杂交方法，在离体条件下把RNA合成互补的DNA（逆转录酶等的作用下）cDNA（4）DNA碱基顺序的测定（b）将这cDNA插入到细菌内的环状DNA分子—质粒（Plasmid）中，再将它导入到培养的E.coli细胞内，或者其它载体，Bac或Y