色层分离法全解

112色层分离法Chromatography2主要内容1概述2色层分离法的产生和发展(基本概念及色谱展开技术)3色层分离的有关术语4各类不同分离机制的色层分离法介绍5色层分离过程理论6层析的放大31.概述色层分离，又叫色谱法、层离法、层析法等。色谱法是利用不同溶质（样品）与固定相和流动相之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次平衡，使各溶质达到相互分离。固定相，通常为表面积很大的或多孔性固体；流动相，液体或气体。42.色层分离法的产生和发展1903年俄国植物学家Tsweet茨维特植物提取液CaCO3玻璃柱石油醚淋洗石油醚色谱色：颜色谱：图谱1906年茨维特论文发表创建5色谱法（chromatography）填充CaCO3的玻璃柱管叫做色谱柱具有大表面积的CaCO3固体颗粒称为固定相(stationaryphase)推动被分离的组分(色素)流过固定相的惰性流体(上述实验用的是石油醚)称为流动相（mobilephase）在柱中出现的有颜色的色带叫做色谱图（chromatogram）。6色谱法（chromatography）色谱分析法实质上是一种物理化学分离方法，即利用不同物质在两相(固定相和流动相)中具有不同的分配系数(或吸附系数)，当两相作相对运动时，这些物质在两相中反复多次分配(即组分在两相之间进行反复多次的吸附、脱附或溶解、挥发过程)从而使各物质得到完全分离。7石油醚流动相石油醚固定相CaCO3原理8分离介质足够的亲水性，保证有较高的收率足够大的多孔性，使大分子能透过有足够强的刚度，可在大生产中使用良好的化学稳定性能引入各种功能团92.2基本概念及其分类色层分离是基于当含有被分离物质的料液渗滤通过有吸附剂离子涂铺的层(薄层层析)或填充的管子(柱层析)时，对混合物各组分产生选择性的阻滞作用。固定相固体或是包埋在惰性固体里的液体移动相气体(GC)或液体(LC)需要离析的样品10纸层析法是分离鉴定蛋白质的氨基酸组成的重要工具。纸层析小实验动画演示甘氨酸半胱氨酸组氨酸缬氨酸11紫外检测器分光光度计P-5磁力搅拌器部分收集器双笔记录仪酶活性紫外吸收蠕动泵层析柱混合泵酶试剂柱层析分离法的有关装置124、色层分离法介绍吸附色层分离法基于溶质分子与固定相作用的机理不同；利用吸附剂对组分的吸附能力的差别进行分离用来填充柱的物质包括无机吸附剂和有机吸附剂。无机吸附剂磷酸钙二氧化钛氢氧化锌氧化铝凝胶澎润土等；静电相互作用特异结合位点有机吸附剂大网格吸附剂聚酰胺等应用于亲水性发酵产物的分离13142.3亲和层析2.3.1亲和作用的本质具有亲和作用的分子（物质）对之间具有“钥匙”和“锁孔”的关系，这是必要条件。除此以外，还需要分子或原子水平的各种相互作用，才能完整地体现亲和结合作用。a.静电作用b.氢键c.疏水性相互作用d.配位键e.弱的共价键152.3亲和层析利用生物体内存在的特异性相互作用的分子对而设计的层析方法。162.3.2原理与操作亲和层析是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相分离法。172.3.3亲和吸附介质2.3.3.1亲和配基a.酶或酶的抑制剂b.抗体或抗原c.A蛋白：A蛋白与IgG有很强的亲和作用。A蛋白存在于黄色葡萄球菌的细胞壁中。d.凝集素（lectin）凝集素是与糖特异结合的蛋白质的总称。不同的凝集素与糖结合的特异性不同。如：ConA与葡萄糖和甘露糖的结合作用较强；麦芽凝集素与N-乙酰葡糖胺的亲和作用较强。182.3.3.1亲和配基e.辅酶和磷酸腺苷脱氢酶的辅酶——NAD、NADP激酶的辅酶——ATPAMP、ADP与上述辅酶的结构类似。f.三嗪类色素三嗪类色素是一类分子内含有三嗪环的合成活性燃料，与各种需要在NAD的存在下表现其生物活性的脱氢酶和激酶具有结合作用，还与血清白蛋白、干扰素、核酸酶、糖解酶等具有很高的亲和力。192.3.3.1亲和配基g.过渡金属离子h.肝素肝素与脂蛋白、脂肪酶、抗凝血酶、凝血酶、FGF等蛋白质具有亲和作用202.3.2载体将亲和配基共价偶联在固体粒子的表面即可制备亲和吸附介质，该固体粒子通常称为配基的载体。2.3.2.1.对载体的要求1）非专一吸附要小、高度亲水、惰性。2）具有大量可供活化和配基结合的化学基团。有稀松的网状结构使大分子能自由进入。3）有较好的化学稳定性和对酶及微生物侵蚀稳定，有良好的机械性能，颗粒均匀。212.3.2.2载体简介1）多孔玻璃载体玻璃对酸碱、有机溶剂及生物侵蚀非常稳定，并且本身又特别坚硬，易于化学键合安装分子臂，是一极为理想的载体。但由于目前价格昂贵，而且有时呈现SiOH基的非特异性吸附，这是最大的缺点。由于其应用上极大优点，克服缺点方面的研究正在进行中。222.3.2.2载体简介2）聚丙烯酰胺凝胶载体丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺的共聚物是一良好载体。具有三向网状结构和碳氢骨架，而它的大量酰胺基支链非但使凝胶具有亲水性，且可供活化。其缺点是在配基偶联后网块缩小不利于亲和层析。3）纤维素载体纤维素是其中最经济的一种可作为固相载体的物质。但纤维素作为亲和层析载体尚有许多缺点：①活化后会产生带电荷的离子；②物理结构紧密，蛋白和核酸的通透性则受空间位阻所阻碍。232.3.2.2载体简介4）葡聚糖凝胶载体葡聚糖凝胶商品名Sephadex，是用环氧氯丙烷作为交联剂，把多聚葡萄糖交联而成的珠状凝胶。其化学性能及物理稳定性都较好，但多孔性能较差。最松散的结构是SephadexG-200，也只能让分子量6×105的球蛋白通过。葡聚糖凝胶只适合与小配基制成亲水吸附剂以及免疫吸附系统，由于用在这方面容量和通透性的要求都不高，一般较常用。242.3.2.2载体简介5）琼脂糖凝胶和交联琼脂糖凝胶载体琼脂糖凝胶是由D-半乳糖和3，6-脱水-半乳糖结合的链状多糖，珠状商品名为Sepharose。特点：高度亲水，具有极松散网状结构，可让上百万分子量的大分子通过。物理和化学性能稳定。在非专一吸附方面，如果缓冲液离子浓度不太高，它对蛋白质几乎没有吸附作用。Sepharose在室温用1mol/L强酸或强碱处理2～3h并不引起颗粒性质的变化。用较浓的尿素或盐酸胍长期处理，亦不引起吸附性能的减弱，即使用蛋白变性剂彻底洗脱大分子物质亦不致引起破坏，这就保证了吸附剂可反复使用。252.3.2.2载体简介琼脂糖凝胶的缺点是它不能象葡聚糖凝胶一样进行干燥和冻干，经不起有机溶剂处理，会引起凝较严重不可逆碎裂。人们用类似葡聚糖凝胶的交联方法发展出另一更为理想的交联琼脂糖凝胶，它具有凝胶的优点而减少其缺点。262.3.3载体活化与偶联271.吸附为减少吸附操作中的非特异性吸附量，所用缓冲液的离子强度要适当，一般为0.1~0.5mol/L。料液流速要适当。2.清洗一般用与吸附操作相同的缓冲液。3.洗脱（1）特异性洗脱法：利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物溶液为洗脱剂。（2）非特异性洗脱：调节洗脱液的pH、离子强度、离子种类等。2.3.4亲和层析操作282930N越大，加入的溶剂越多，展开的时间越长色带下移高峰浓度减少、色带扩大312.4凝胶过滤层析2.4.1原理凝胶过滤层析是利用凝胶分子为固定相，根据料液中溶质相对分子量的差别进行分离的液相层析法。323334几个相关的概念35外水体积（V0）：指固定相颗粒之间的体积，也称空隙体积。内水体积（Vi）：凝胶颗粒内部微孔的总体积。保留体积（VR）：将某溶质从层析柱上洗脱下来所用的体积，也称洗脱体积。柱床体积（Vt）：指填充固定相体积362.4.2凝胶层析介质2.4.2.1介质的种类GFC常用于蛋白质等生物大分子的分级分离和脱盐，因此良好的凝胶过滤介质应满足以下要求：1）亲水性高，表面惰性；2）稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围内稳定；3）具有一定的孔径分布范围；4）机械强度高，允许较高的操作压力。37常用的GFC介质有：葡聚糖凝胶：SephadexG系列，G10~G200琼脂糖凝胶：Sepharose系列，2B,4B,6B382.4.2.2凝胶特性参数1）排阻极限（exclusionlimit):是指不能扩散到凝胶网格内部的最小分子的相对分子量。如SephadexG-50为30kD。2）分级范围（fractionationrange)：即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子量范围。如SephadexG-50为1.5kD~30kD。3）溶胀率：溶胀后每1g干胶所吸收水分的百分数。4）凝胶粒径：凝胶颗粒的直径。5）床体积（bedvolume):即1g干胶溶胀后所占有的体积。392.4.2.3凝胶层析的操作1.凝胶的选择和预处理（1）凝胶的选择分组分离分级分离（2）凝胶的处理2.凝胶柱的装填和标定3.加样分组分离：一般为柱体积的30%分级分离：柱体积的1%~5%4.洗脱与收集402.5离子交换层析离子交换层析是利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的层析方法。4142432.6疏水作用色层分离法根据分子表面疏水性差别分离蛋白质和多肽等生物大分子的液相色谱法20世纪70年代初发展相互作用疏水效应(疏水键)*，静电作用，氢键，电荷转移作用，载体的化学结构作用442.6疏水作用色层分离法首要条件载体的活化与配体的偶联452.6疏水作用色层分离法用乙酐使N-取代异脲乙酰化破坏静电荷以无电荷醚键的形式插入琼脂糖基质462.6疏水作用色层分离法主要应用纯化多种蛋白粗提物互换酶的分离蛋白质亚基与蛋白质聚合物的分离多肽与蛋白碎片的分离完整细胞的选择性吸附472.7金属螯合色层分离法首先，制备金属螯合介质其次，螯合482.7金属螯合色层分离法应用要依赖金属或直接与金属作用的蛋白、肽类、核苷酸、核酸及酶的固定化和混合金属离子分离492.8共价作用色层分离法利用溶质分子与层析剂凝胶间的共价吸附作用将目的产物与其他溶质分子分离开来的方法。制备层析剂二硫键层析剂葡聚糖凝胶或琼脂糖胶谷胱甘型二硫键层析剂巯基丙基型二硫键层析剂交链聚丙烯酰胺带巯芳基的活性层析剂502.8共价作用色层分离法应用：昂贵；共价结合具有特异性、牢固并且在适当的操作条件下还可获得较高的收率和纯度。分离半胱氨酸；分离含半胱氨酸的肽段；分离含-SH基的蛋白质或进一步分离该蛋白质中-SH基附近的肽段51分类原则类型特征据溶质分子与固定相相互作用的机理不同吸附色谱离子交换色谱疏水作用层析金属螯合色谱共价作用色谱分配色谱凝胶过滤亲和色谱吸附力不同各物质与固定相之间的离子交换能力的不同各物质与固定相之间的疏水作用的强弱不同各物质与固定相上的金属离子的络合能力的不同巯基化合物的巯基与固定相表面的二硫键作用力不同各物质在两液相间的分配系数不同各物质的分子大小或形状不同利用生物大分子与各种配基的生物识别能力不同52作业简述色层分离的基本过程。色谱展开技术有哪几种？疏水作用色层分离法、离子交换色层分离法、聚焦色层分离法、凝胶过滤色层分离法、亲和色层分离法的原理。