氨基酸发酵生产工艺学

第十二章氨基酸生产工艺Jiaxinguniversity氨基酸α碳原子分别以共价键连接氢原子、羧基和氨基及侧链。侧链不同，氨基酸的性质不同。氨基酸是构成蛋白成分目前世界上可用发酵法生产氨基酸有20多种。Jiaxinguniversity氨基酸的用途•1.食品工业：•强化食品(赖氨酸，苏氨酸，色氨酸于小麦中)•增鲜剂：谷氨酸单钠和天冬氨酸苯丙氨酸与天冬氨酸可用于制造低热量二肽甜味剂(α-天冬酰苯丙氨酸甲酯),此产品1981年获FDA批准,现在每年产量已达数万吨。Jiaxinguniversity•2.饲料工业：•甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料•3.医药工业：•多种复合氨基酸制剂可通过输液治疗营养或代谢失调•苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气对骨髓肿瘤治疗有效,且副作用低。4.化学工业：谷氨基钠作洗涤剂,丙氨酸制造丙氨酸纤维。Jiaxinguniversity氨基酸的生产方法2、发酵法：直接发酵法：利用微生物作用直接将粮食原料经过发酵生产氨基酸的方法。添加前体法：在发酵中添加氨基酸代谢途径上的中间产物，利用微生物将其转化为氨基酸的过程，可避免合成途径中的反馈抑制作用。1、提取法：蛋白质水解，从水解液中提取。胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸合成法：DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。Jiaxinguniversity•前体是指加入到发酵培养基中的某些化合物，它能被微生物直接结合到产物分子中去，而自身的结构无多大变化，有些还有促进产物合成的作用。•中间体是指养分或基质进入一途径后被转化为一种或多种不同的物质，它们均被进一步代谢，最终获得该途径的终产物。•诱导物是指那些在生长期内促进生物合成的化合物。Jiaxinguniversity•酶法：利用微生物细胞或微生物产生的酶来制造氨基酸。•合成法：用化学合成的方法制造氨基酸DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。•酶法和化学合成法由于前体物的成本高，工艺复杂，难以达到工业化生产的目的，蛋白质水解，从水解液中提取，胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸。（表9-5）Jiaxinguniversity氨基酸发酵生产发展现状•生产氨基酸的大国为日本和德国。•日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能生产高品质的氨基酸，可直接用于输液制剂的生产。•Jiaxinguniversity表3--8世界氨基酸主要生产厂家生产能力品名厂家生产能力品名厂家生产能力蛋氨酸日本曹达20000谷氨酸味之素60000蛋氨酸日本住友化学5000谷氨酸日本旭化成15000蛋氨酸日本化药2500谷氨酸协和发酵15000蛋氨酸德国迪高沙85000谷氨酸日本武田药品15000蛋氨酸法国AEC105000色氨酸味之素100蛋氨酸美国孟山都45000色氨酸昭和电工200蛋氨酸墨西哥阿尔拜梅克斯5000色氨酸三井东压100蛋氨酸西班牙Sodeti4000色氨酸田造制药50蛋氨酸苏联Volgograd4000色氨酸日本化药50色氨酸协和发酵50赖氨酸日本味之素55000甘氨酸日本有机合成化学6000赖氨酸日本协和发酵20500甘氨酸协和发酵5000赖氨酸日本东丽6500甘氨酸日本化药1000赖氨酸南朝鲜味元10000丙氨酸武藏野化学研究所——丙氨酸日本化药——Jiaxinguniversity二、氨基酸合成的代谢调控•发酵工程要求微生物大量地合成特定的代谢产物，这一目的只有当微生物的部分代谢调控机制遭到破坏时才能达到。用人工诱变的方法有目的地改变微生物固有的调节机制，使合成产物的途径畅通无阻，按照人们所需要的方向进行，最大限度地过量积累特定产物，这种发酵称为代谢控制发酵。是氨基酸代谢控制发酵的基本策略之一Jiaxinguniversity•氨基酸代谢调控模式：•基本调节机制：反馈控制，在分支点出优先合成•特殊调节机制：协同反馈抑制、合作反馈抑制、同工酶控制、顺序控制、平衡合成、代谢互锁Jiaxinguniversity黄色短杆菌杆菌的苏氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的合成是与分枝途径相联系的异亮氨酸JiaxinguniversityJiaxinguniversity2.2用营养缺陷变异株的方法（切断支路代谢）•这一方法是诱变出菌体内氨基酸生物合成某步反应阻遏的营养缺陷型变异体，使生物合成在中途停止，不让最终产物起控制作用。•这种方法中有用高丝氨酸缺陷株的赖氨酸发酵，有用精氨酸缺陷株的鸟氨酸发酵，还有用异亮氨酸缺陷株的脯氨酸发酵。Jiaxinguniversity2.3类似物抗性变异株的方法（解除反馈调节）•用一种与自己想获得的氨基酸结构相类似的化合物加入培养基内，使其发生控制作用，从而抑制微生物的生长。这样，就可以得到在这种培养基中能够生长的变异株，而这种变异株正是解除了调控机制的，能够生成过量的氨基酸。•利用此方法发酵的有:苏氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、组氨酸和精氨酸。Jiaxinguniversity2、4选育渗漏缺陷型突变菌株指因突变所产生的不完全遗传障碍，其基因所控制的反应程度不象野生型，但多少还能进行，称这种现象为渗漏（leakage），具有这种性质的突变型就称为渗漏突变型。2、5选育温度敏感突变菌株具有温度条件限制的突变型生物体。当其生长温度从限制性温度范围发生由低到高(热敏)或由高到低(冷敏)改变时，某种基因产物的活性丧失或改变，从而导致野生型转变为突变型。Jiaxinguniversity2.6体内及体外基因重组的方法•体内基因重组在应用上又称为杂交育种，主要方法包括：转化、转染、接合转移、转导和细胞融合等，这都是在细胞内暂时地产生染色体的局部二倍体，在两条DNA链之间引起两次以上的交叉，是遗传性重组现象。•细胞内基因重组技术的缺点是，现在只在同种或有近缘关系的微生物之间进行并较难成功。Jiaxinguniversity2.7控制细胞膜的渗透性(1)通过生理学手段控制细胞膜渗透性(2)通过细胞膜缺损突变控制细胞膜渗透性生物素谷氨酸细胞膜渗透性青霉素谷氨酸油酸缺陷型油酸Jiaxinguniversity氨基酸发酵的工艺控制•菌种•培养基•温度•氧•pHJiaxinguniversity1、菌种1.棒状杆菌属(Corynebacterium)：谷氨酸棒杆核菌Cornebateiumgho-tamlkns）2.短杆菌属(Brevibacterium)：黄色短杆菌（Bteuibaterunflavum）、乳糖发酵短杆菌（Bra.lactofementum）3.小杆菌属(Microbacterium)：嗜氨小杆菌（Micrbateriumammoniaphilmn）4.节杆菌属(Arthrobacterium)防止污染和退化Jiaxinguniversity3、培养基1、碳源：淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、乙醇、烷烃碳源浓度过高时，对菌体生长不利，氨基酸的转化率降低。选择：菌种性质、生产氨基酸种类和所采用的发酵操作决定碳源种类Jiaxinguniversity2、氮源：无机氮源：铵盐、尿素、氨水•供氨基酸生产所需要的氮，同时调整pH值。•尿素：脲酶灭菌时形成磷酸铵镁盐，须单独灭菌分批流加，少量多次•氨水：用pH自动控制连续流加有机机氮源：玉米浆、豆饼、棉籽饼生长因子调控Jiaxinguniversity3、合适C/N氮源用于调整pH。合成菌体。生成氨基酸，因此比一般微生物发酵的C/N低。Jiaxinguniversity4、磷酸盐：对发酵有显著影响。过高时葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力抑制。不足时糖代谢受抑制。5、镁：是已糖磷酸化酶、柠檬酸脱氢酶和羧化酶的激活剂，并促进葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力。6、钾：促进糖代谢。谷氨酸产酸期钾多利于产酸，钾少利于菌体生长。Jiaxinguniversity7、钠：调节渗透压作用，一般在调节pH值时加入。8、锰：是许多酶的激活剂。9、铁：是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的活性基的组成分，可促进谷氨酸产生菌的生长。10、铜离子：对氨基酸发酵有明显毒害作用。11、硫：含硫氨基酸，辅酶A，谷胱甘肽Jiaxinguniversity•生长因子：生物素作用：影响细胞膜透性和代谢途径。浓度：过多促进菌体生长，氨基酸产量低。过少菌体生长缓慢，发酵周期长。与其它培养条件的关系：氧供给不足，生物素过量时，发酵向其它途径转化。种类：玉米浆、麸皮水解液、甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜为来源。Jiaxinguniversity3、温度对氨基酸发酵的影响及其控制•菌体生长达一定程度后再开始产生氨基酸，因此菌体生长最适温度和氨基酸合成的最适温度是不同的。分段合理控制•菌体生长温度过高，则菌体易衰老，pH高，糖耗慢，周期长，酸产量低。•采取措施：少量多次流加尿素，维持最适生长温度，减少风量等，促进菌体生长。Jiaxinguniversity氧对氨基酸发酵的影响及其控制•要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸发酵：生物合成与TCA循环有关。供氧足够时产量最大•适宜在缺氧条件下进行的亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸发酵：菌体呼吸受阻时产量最大。•供氧不足时产酸受轻微影响的天冬氨酸族氨基酸发酵JiaxinguniversitypH对氨基酸发酵的影响及其控制•作用机理：主要影响酶的活性和菌的代谢。•控制pH方法：流加尿素和氨水•流加方式：根据菌体生长、pH变化、糖耗情况和发酵阶段等因素决定。Jiaxinguniversity控制：（1）菌体生长或耗糖慢时，少量多次流加尿素，避免pH过高（2）菌体生长或耗糖过快时，流加尿素可多些，以抑制菌体生长。（3）发酵后期，残糖少，接近放罐时，少加或不加尿素，以免造成氨基酸提取困难。（4）氨水对pH影响大，应采取连续流加。Jiaxinguniversity谷氨酸生产工艺谷氨酸在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，另外具有较高的营养价值，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。医学上谷氨酸结合血氨生成谷氨酰胺，主要用于治疗肝性昏迷，还用于改善儿童智力发育。参与脑蛋白代谢和糖代谢，改进和维持脑功能食品工业上，味精是常用的增鲜剂，其主要成分是谷氨酸钠盐。Jiaxinguniversity1、糖密的预处理：降低生物素的含量活性炭处理法、水解活性炭处理法、树脂处理法•酸解法：以酸催化，在高温高压下将淀粉水解转化为葡萄糖的方法。2、淀粉水解糖的制备方法过去生产味精主要用小麦面筋(谷蛋白)水解法进行，现改用微生物发酵法来进行大规模生产。（1）谷氨酸生产原料及其处理淀粉、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、醋酸、乙醇、正烷烃等Jiaxinguniversity1.淀粉水解糖的制备：酸水解或酶水解酸水解法–调浆：干淀粉用水调成10-110Bx的淀粉乳，加盐酸0.5-0.8％至pH1.5。–糖化：蒸汽加热，加压糖化20min。冷却至80℃下中和。–中和：烧碱中和，至pH4.0-5.0–脱色：活性炭脱色和脱色树脂。活性炭用量为0.6-0.8％–过滤除杂：沉淀1~2h,冷却至45~50摄氏度，过滤器除杂，储藏桶储藏。–控制好温度：温度高蛋白等杂质沉淀不完全温度低，粘度大，过滤困难Jiaxinguniversity酶解法：利用淀粉酶将淀粉水解转化为葡萄糖的方法液化：一次升温液化法和连续进出料液化法–将淀粉乳调成13－14°Bè，用Na2CO3调pH6.2-6.4，用CaCl2调节浆中的Ca2+至50mg/L以及a-淀粉酶（8~10u/g，干淀粉计算)，加热到88—90℃，保温15－20min--碘液检查，显色反应棕色，反应终点。升温至100℃，灭酶5－10min，再经板式换热器冷却至70℃以下，进入糖化罐。–糖化：30%淀粉液化液加入开口桶内，按每克淀粉加糖化酶（80－100u/g，干淀粉计算)，在一定温度和pH下糖化，48h后用无水酒精检查糖化是否完全–糖化结束，升温至80，加热20min灭酶，一般糖化温度55--60℃，pH4.0-4.5；–过滤：糖液先用Na2CO3水溶液调pH4.8-5.0，过滤。Jiaxinguniversity酸酶结合法：集酸法和酶法制糖的优点而采用的结合生产工艺根据原料淀粉性质，又