第二章 提取分离和鉴定的方法2

第二章提取分离和鉴定方法第二章提取分离和鉴定方法第一节天然药物有效成分的提取第二节天然药物有效成分的分离与纯化第三节结构研究方法（四大光谱）第一节天然药物有效成分的提取（常用的溶剂的性质）环己烷，石油醚，苯，氯仿，乙醚，乙酸乙酯，正丁醇，丙酮，乙醇，甲醇极性：小大亲脂性：大小亲水性：小大1、比水重的有机溶剂：氯仿2、与水分层的有机溶剂：环己烷~正丁醇3、能与水分层的极性最大的有机溶剂：正丁醇4、与水可以以任意比例混溶的有机溶剂：丙酮~甲醇5、极性最大的有机溶剂：甲醇6、极性最小的有机溶剂：环己烷7、常用来从水中萃取苷类、水溶性生物碱类成分的有机溶剂：正丁醇8、溶解范围最广的有机溶剂：乙醇第一节天然药物有效成分的提取（常见的提取方法）1、溶剂提取法（浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法、连续回流提取法等）2、水蒸气蒸馏法3、升华法。1、溶剂提取法（1）溶剂提取法的原理：相似相溶原理（2）各种溶剂提取法溶剂提取法一般包括浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法、连续回流提取法等，其使用范围及特点见下表。第一节天然药物有效成分的提取（常见的提取方法）提取方法溶剂操作提取效率使用范围备注浸渍法水或有机溶剂不加热效率低各类成分，尤遇热不稳定成分出膏率低，易发霉，需加防腐剂渗漉法有机溶剂不加热—脂溶性成分消耗溶剂量大，费时长煎煮法水直火加热—水溶性成分易挥发、热不稳定不宜用回流提取法有机溶剂水浴加热—脂溶性成分热不稳定不宜用，溶剂量大连续回流提取法有机溶剂水浴加热节省溶剂、效率最高亲脂性较强成分用索氏提取器，时间长1、溶剂提取法第一节天然药物有效成分的提取（常见的提取方法）2、水蒸气蒸馏法适用于具有挥发性、能随水蒸汽蒸馏而不被破坏、难溶或不溶于水的成分的提取，如挥发油、小分子的香豆素类、小分子的醌类成分。3、升华法：固体物质受热不经过熔融，直接变成蒸汽，遇冷后又凝固为固体化合物，称为升华。中草药中有一些成分具有升华的性质，可以利用升华法直接自中草药中提取出来。如樟脑、咖啡因。第一节天然药物有效成分的提取（常见的提取方法）第二节天然药物有效成分的分离与纯化1、根据物质溶解度差别进行分离；2、根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离；3、根据物质的吸附性差别进行分离；4、根据物质分子大小进行分离；5、根据物质解离程度不同进行分离；6、根据物质的沸点进行分离。2.1物质溶解度差别1、结晶及重结晶法2、溶剂分离法利用不同温度可引起物质溶解度的改变的性质以分离物质。结晶:将不是结晶状态的固体物质处理成结晶状态的操作；重结晶:将不纯的结晶进一步精制成较纯的结晶的过程。1、结晶及重结晶法2、溶剂分离法（1）溶剂选择的一般原则：不反应；冷时对所需要的成分溶解度较小，而热时溶解度较大；对杂质溶解度很大或很小；沸点低，易挥发；无毒或毒性小。若无理想的单一溶剂时，可以考虑使用混合溶剂。一般常用甲醇、丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙酯等。2.1物质溶解度差别（2）结晶操作：结晶操作实际是进一步分离纯化过程，一般是应用适量的溶剂在加热至沸点的情况下将化合物溶解，制成过饱和溶液，趁热过滤去除不溶性杂质，放置冷处，以析晶。1、结晶及重结晶法2、溶剂分离法2.1物质溶解度差别（3）结晶纯度的判定：结晶形态和色泽：单一化合物的结晶具有结晶形状均一和均匀的色泽。熔点和熔距：单一化合物具有一定的熔点和较小的熔距，结晶前后的熔点应一致，熔距很窄，在1℃2℃的范围内。但要注意双熔点，如汉防己乙素、芫花素及一些与糖结合的苷类化合物。色谱法：单一化合物在薄层色谱或纸色谱层析中经三种不同的溶剂系统展开，均为一个斑点者。1、结晶及重结晶法2、溶剂分离法2.1物质溶解度差别1、结晶及重结晶法2、溶剂分离法（1）在中草药提取液中加入另一种溶剂以改变混合物溶剂的极性，使一部分物质沉淀析出，从而实现分离。如：水—醇法除多糖、蛋白质等水溶性杂质；醇—水法除树脂、叶绿素等水不溶性杂质；醇—醚法或醇—丙酮法使苷类成分，而脂溶性树脂等杂质则存留在母液中。2.1物质溶解度差别（2）对酸性、碱性或两性有机化合物来说，通常通过加入酸、碱以调节溶液的pH，以改变分子的存在状态（游离型或解离型），从而改变溶解度而实现分离。如：酸提碱沉法，碱提酸沉法等。1、结晶及重结晶法2、溶剂分离法2.1物质溶解度差别（3）沉淀法：酸性或碱性化合物还可通过加入某种沉淀试剂使之生成水不溶性的盐类沉淀等析出。如加入铅盐、雷氏铵盐等。1、结晶及重结晶法2、溶剂分离法2.1物质溶解度差别第二章提取分离和鉴定方法2.2物质在两相溶剂中的分配比不同1．两相溶剂萃取法2．液—液分配柱色谱3．加压相色谱法1．两相溶剂萃取法（1）原理：利用混合物中各成分在两相互不相溶的溶剂中分配系数的不同而实现分离。萃取时如果各成分在两相溶剂中分配系数相差越大，则分离效率越高。2.2物质在两相溶剂中的分配比不同1．两相溶剂萃取法（2）各种萃取方法：①简单萃取：利用分液漏斗进行两相溶剂萃取。②逆流连续萃取法：是一种连续的两相溶剂萃取法。其装置可具有一根、数根或更多根的萃取管。2.2物质在两相溶剂中的分配比不同1．两相溶剂萃取法（2）各种萃取方法：③逆流分配法（CCD）：又称逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法，与两相溶剂逆流萃取法原理一致，对于分离具有非常相似性质的混合物效果较好。2.2物质在两相溶剂中的分配比不同1．两相溶剂萃取法（2）各种萃取方法：④液滴逆流分配法（DCCC）：本法必须选用能生成液滴的溶剂系统，且对高分子化合物的分离效果较差，处理样品量小，并要有一定的设备，操作较繁琐。一般50时，简单萃取即可分离，50时，则易采用逆流分溶法。2.2物质在两相溶剂中的分配比不同2．液—液分配柱色谱：原理：分配原理支持剂：硅胶、硅藻土、纤维素粉等正相分配色谱：固定相：水、缓冲溶液流动相：固定相饱和的氯仿、乙酸乙酯、丁醇等弱极性有机溶剂洗脱顺序：化合物极性越小，越先出柱；反之，化合物极性越大，越后出柱。应用：通常用于分离水溶性或极性较大的成分，如生物碱、苷类、糖类、有机酸等化合物。2.2物质在两相溶剂中的分配比不同2．液—液分配柱色谱：应用：通常用于分离水溶性或极性较大的成分，如生物碱、苷类、糖类、有机酸等化合物。2.2物质在两相溶剂中的分配比不同NCH3CH3pKa9.30OOHOHOHOHOR3．液—液分配柱色谱：反相分配色谱：固定相：石蜡油、化学键合固定相流动相：固定相饱和的水或甲醇等强极性有机溶剂洗脱顺序：化合物极性越大，越先出柱；反之，化合物极性越小，越后出柱。应用：适合于分离脂溶性化合物，如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等。2.2物质在两相溶剂中的分配比不同常用反相硅胶薄层色谱及柱色谱的填料是普通硅胶经下列方式进行化学修饰，键合上长度不同的烃基（R）、形成亲油表面而成。其中以硅烷化键合型最为常用，其根据烃基（R）长度（—C2H5、—C8H17、—C18H37、）分别命名为：RP—2、RP—8、RP—18。三者亲脂性强弱顺序如下：RP—18RP—8RP—2。键合固定相的作用并非只是分配，也有一定的吸附作用。2.2物质在两相溶剂中的分配比不同加压相色谱法又分为：快速柱色谱（约2.02105Pa），Lobar低压柱色谱（5.05105Pa），中压柱色谱（5.0520.2105Pa），分析用HPLC，制备用HPLC（20.2105Pa）。固定相：RP—2、RP—8或RP—18流动相：水—甲醇或水—乙腈洗脱顺序：化合物极性越大，越先出柱；反之，化合物极性越小，越后出柱。应用：通常用于分离水溶性或极性较大的成分，如苷类、酚性化合物等。3．加压相色谱法2.2物质在两相溶剂中的分配比不同2.3物质的吸附性差别以固—液吸附用的最多;物理吸附（硅胶、氧化铝、活性炭为吸附剂进行的吸附色谱）;化学吸附（黄酮等酚酸性物质被氧化铝吸附、生物碱被酸性硅胶吸附等）;半化学吸附（聚酰胺与黄酮类、醌类等酚性化合物之间的氢键吸附，吸附力较弱，介于物理吸附与化学吸附之间）之分。1．物质的吸附规律2．极性及其强弱判断3．吸附柱色谱法用于物质的分离4．聚酰胺吸附色谱法5．大孔吸附树脂2.3物质的吸附性差别1．物质的吸附规律（1）物理吸附过程一般无选择性，但吸附强弱大体遵循“相似者易于吸附”的经验规律。（2）被分离的物质与吸附剂、洗脱剂共同构成吸附层析的三要素，彼此紧密相连。2.3物质的吸附性差别1．物质的吸附规律常用的非极性吸附剂：活性炭。对非极性物质具有较强的亲和力，在水中对溶质表现出强的吸附能力。从活性炭上洗脱被吸附的物质时，溶剂的极性越小，洗脱能力越强。2.3物质的吸附性差别常用的极性吸附剂：硅胶、氧化铝。硅胶显微酸性，适于分离酸性和中性化合物，分离生物碱时需在流动相中加入适量的有机碱；氧化铝呈碱性，适于分离生物碱等碱性成分，不宜用于分离有机酸、酚性等酸性成分。1．物质的吸附规律2.3物质的吸附性差别硅胶、氧化铝均为极性吸附剂，故有以下特点：①被分离物质极性越强，吸附力越强。强极性溶质将优先被吸附。②溶剂极性越弱，则吸附剂对溶质的吸附能力越强。随溶剂极性的增强，则吸附剂对溶质的吸附力将减弱。③当加入极性较强的溶剂后，先前被硅胶或氧化铝所吸附的溶质可被置换而洗脱出来。1．物质的吸附规律2.3物质的吸附性差别2．极性及其强弱判断（1）一般化合物的极性按下列官能团的顺序增强：—CH2—CH2—，—CH2=CH2—，—OCH3，—COOR，C=O，—CHO，—NH2，—OH，—COOH（2）溶剂的极性可大体根据介电常数的大小来判断。介电常数越大，则极性越大。一般溶剂的介电常数按下列顺序增大：环己烷（1.88），苯（2.29），无水乙醚（4.47），氯仿（5.20），乙酸乙酯（6.11），乙醇（26.0），甲醇（31.2），水（81.0）2.3物质的吸附性差别3．吸附柱色谱法用于物质的分离以硅胶或氧化铝为吸附剂进行柱色谱分离时：（1）尽可能选用极性小的溶剂装柱和溶解样品，或用极性稍大的溶剂溶解样品后，以少量吸附剂拌匀挥干，上柱。（2）一般以TLC展开时使组分Rf值达到0.2~0.3的溶剂系统作为最佳溶剂系统进行洗脱。实践中多用混合的有机溶剂系统。2.3物质的吸附性差别2.3物质的吸附性差别3．吸附柱色谱法用于物质的分离（3）为避免化学吸附，酸性物质宜用硅胶、碱性物质宜用氧化铝作为吸附剂进行分离。通常在分离酸性（或碱性）物质时，洗脱溶剂中常加入适量的醋酸（或氨、吡啶、二乙胺），以防止拖尾、使斑点集中。2.3物质的吸附性差别4．聚酰胺吸附色谱法（1）原理：氢键吸附。一般认为系通过分子中的酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物的酚羟基，或酰胺键上的游离胺基与醌类、脂肪酸上的羰基形成氢键缔合而产生吸附。吸附强弱取决于各种化合物与之形成氢键缔合的能力。2.3物质的吸附性差别（2）吸附能力的强弱通常化合物在水溶剂中大致有以下规律：①形成氢键的基团数目越多，则能力越强。②成键位置对吸附能力也有影响。易形成分子内氢键者，其在聚酰胺上的吸附响应减弱。4．聚酰胺吸附色谱法2.3物质的吸附性差别③分子中芳香化程度高，则吸附性增强；反之，则减弱。一般情况下，各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力由弱致强的大致顺序如下：水—甲醇—乙醇—氢氧化钠水溶液—甲酰胺—二甲基甲酰胺—尿素水溶液其中，最常应用的洗脱系统是：乙醇—水4．聚酰胺吸附色谱法2.3物质的吸附性差别4．聚酰胺吸附色谱法（3）应用：①特别适合于酚类、黄酮类化合物的制备和分离。②脱鞣质处理③对生物碱、萜类、甾类、糖类、氨基酸等其他极性与非极性化合物的分离也有着广泛的用途。2.3物质的吸附性差别5．大孔吸附树脂通常分为极性和非极性两类。（1）原理：吸附性和分子筛性相结合。吸附性是由范德华引力或氢键引起的。分子筛是由于其本身多孔性结构产生的。2.3物质的吸附性差别5．大孔吸附树脂（2）影响因素：①一般非极性化合物在水中易被非极性树脂吸附，极性化合物在水中易被极性树脂吸附。糖是极性水溶性化合物，与D型非极性树脂吸附作用很弱。②物质在溶剂中的溶解度大，树脂对此物质的吸附