质粒DNA限制性酶切图谱分析

一、DNA的限制性酶切实验原理质粒质粒DNADNA限制性酶切图谱分析限制性酶切图谱分析„核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统，用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。„限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。„根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。„第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。1.限制性内切酶的类型一、DNA的限制性酶切实验原理¾第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。1.限制性内切酶的类型一、DNA的限制性酶切实验原理„第三类（Ⅱ型）限制性内切酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶.„它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段；„Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序；„Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。„正是得益于限制性的内切酶的发现和应用，才使得人们能在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。1.限制性内切酶的类型一、DNA的限制性酶切实验原理粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。如EcoRI的识别顺序为：5’……G|AATTC……3’3’……CTTAA|G……5’在双链上交错切割的位置切割后生成5’……GAATTC……3’3’……CTTAAG……5’各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV的识别位置是：5’……GAT|ATC……3’3’……CTA|TAG……5’切割后形成5’……GATATC……3’3’……CTATAG……5’这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。平头末端：™用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如E.coli用Eco表示，所以用斜体字。™用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(Heamophilusinfluenzae)Rd菌株用d，即Hind。™如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰酶，则以罗马数字表示，如HindⅠ,HindⅡ，HindⅢ等。2.限制性核酸内切酶的命名法一、DNA的限制性酶切实验原理由pUC18改造而来，大小为3162bp。相当于在pUC18中增加了带有M13噬菌体DNA合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。二、琼脂糖凝胶电泳实验原理琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。二、琼脂糖凝胶电泳实验原理（1）琼脂糖含液体量大，可达98-99%，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。（2）电泳速度快。（3）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定。（4）样品易回收，常用于制备。琼脂糖电泳的优点™配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围常用的电泳缓冲液4℃保存备用.常用的6X载样缓冲液Ⅰ0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40%蔗糖水溶液Ⅱ0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，30%甘油水溶液三材料、设备及试剂质粒：pUC118、pEGFP设备：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，台式高速离心机，电泳仪、电泳槽、UVP凝胶成像系统、微波炉试剂：琼脂糖、TAE电极缓冲液、LamdarDNAEcoRI/HindⅢ、EB、加样缓冲液四、操作步骤1、质粒DNA的限制性酶切反应（1）、将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管编号,用微量移液枪分别加入DNA5μl，10×缓冲液2μl,BSA2ul，EcoRI1ul，ddH2O10ul，用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。（2）、混刀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温1小时,使酶切反应完全。（3）、每管加入2μl0.1mol/LEDTA(pH8.0),混刀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。2、琼脂糖凝胶电泳(1)称取0.25g琼脂糖，置25ml电泳缓冲液中，加热使琼脂糖溶解；(2)待溶液冷至60℃，加入2ulSYBRGreenI。(3)在距离胶模底板0.5-1mm处放置电泳梳，将琼脂糖溶液倒入胶模中，厚度约3-5mm，注意避免产生气泡；(4)凝胶完全凝固后，移去梳子和挡板，将凝胶放入电泳槽。加入TAE缓冲液使恰好没过胶面约1mm；(5)将DNA样品与1/6体积加样缓冲液混合后，加入样品槽中；(6)接通电源，使样品槽在负极端，用80V的电压，至溴酚蓝到胶前沿时，停止电泳。(7)凝胶自动处理系统（UVP）观察和拍照，记录结果。样品：DNA5ul、6X点样液2ul，电极缓冲液5ulpUC118、pEGFP、pUC118/EcoRI、pEGFP/EcoRI、细菌基因组DNADNAMarker(2ul，6X点样液2ul，电极缓冲液5ul)实验结果：分析酶切图谱１．内切酶：„不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染；„注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；„内切酶的用量：根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定，通常1u指在适当条件下，1小时内完全酶解１ug特定ＤＮＡ底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以１ugDNA对２－３u酶短时间为宜。„同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力；„内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。五、注意事项五、注意事项————限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切„作为内切酶底物，ＤＮＡ应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。„这种抑制可通过：增加酶作用单位数（10~20U/ugDNA）、增大反应体积以稀释可能的抑制剂或延长反应时间加以克服。五、注意事项五、注意事项————限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切２．ＤＮＡ：„反应缓冲液主要由Tris·HCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+为内切酶辅基；„Tris·HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间；„NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度：低盐（10mMNaCl)中盐（50mMNaCl）高盐（100mMNaCl）„不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。五、注意事项五、注意事项————限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切３．反应缓冲液：„大多数限制酶反应温度为３７℃，如EcoRⅠ,HindⅢ,BamHⅠ,PstⅠ等，也有如BclⅠ需在５０℃下进行反应，„反应时间根据酶的单位与ＤＮＡ用量之比来定，原则是酶：ＤＮＡ=２－３：１„２小时即可，充分酶解。五、注意事项五、注意事项————限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切４．酶解温度与时间：五、注意事项五、注意事项————DNADNA凝胶电泳凝胶电泳•1.琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。•2.凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。•3.电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和pH，应常更新电泳缓冲液。•4.样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5μg的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定。当加样孔大时，样品上样量应相应加大，否则会造成条带浅甚至辩认不清；反之则应适当减少加样量，但是上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。•5.DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。五、注意事项五、注意事项————DNADNA凝胶电泳凝胶电泳1.内切酶失活2.DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子3.条件不适（试剂、温度）4.DNA酶切位点上的碱基被甲基化5.DNA酶切位点上没有甲基化（如DpnI）6.DNA位点上存在其它修饰7.DNA不存在该酶识别顺序1.标准底物检测酶活性2.将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA3.检查反应系统是否昀佳4.换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株5.换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如San3AI代替DpnI)，重新将质粒转至dcm+dam+菌株中扩增6.将DNA底物与λDAN混刀进行切割验证7.换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证六、六、限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切常见问题分析常见问题分析‰问题一：DNA完全没有被内切酶切割原因对策1.内切酶活性下降2.内切酶稀释不正确3.DNA不纯，反应条件不佳4.内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰5.部分DNA溶液粘在管壁上6.内切酶溶液粘度大，取样不准7.酶切后DNA粘末端退火8.由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性9.过度稀释使酶活性降低10.反应条件不适11.识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序1.用5-10倍量过量消化2.用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶3.同上4.同上5.反应前离心数秒6.将内切酶稀释，增大取样体积7.电泳前将样品置65℃保温5-10分钟，取出后置冰浴骤冷8.使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡9.适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏10.使用昀佳反应体系11.加大酶量5-10倍‰问题二：DNA切割不完全原因对策六、六、限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切常见问题分析常见问题分析1.内切酶星状活性2.其它内切酶污染3.底物中含其它DNA杂质1.检查反应条件：甘油浓度大于12%，盐度过低，Mn2+的存在及酶：DNA值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量2.用λDNA作底物检查酶切结果3.电泳检查DNA，换用其它酶切，纯化DNA片段‰问题三：DNA片段数目多于理论值原因对策六、六、限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切常见问题分析常见问题分析1.DNA定量错误（如RNA含量较高）2.在酶切反应液中形成非特异的沉淀1.用RNA酶A（无DNA酶）100ug