4th day质粒的提取和电泳

目的DNA片段质粒TA载体连接重组质粒目的DNA转化无质粒的E.Coli死亡有质粒的E.Coli存活含抗生素培养基中生长重组质粒的鉴定PCR开始上课时介绍2-3min平板筛选上次实验小结1、观察自己组的实验结果：转化平板*培养板在37C培养12-16h卫星菌：培养时间过长2、实验中的难点*制备效率高的感受态细胞o小量制备质粒和电泳分析实验四开始实验操作前：本次实验介绍10-15min质粒……质粒载体是存在于细菌染色体外的小型闭合环状双链DNA分子，在宿主细胞内可独立自主复制并赋予宿主细胞一定的遗传性状筛选标记MCS（多克隆位点）复制原点质粒1)培养细菌使质粒扩增；2)收集裂解细菌；3)分离纯化质粒DNA。质粒提取原理：质粒提取有多种方法，但都包含有3个基本步骤：√去除蛋白质√去除基因组DNA√去除RNA*酚-氯仿抽提法*RNase消化？？？质粒DNA与基因组DNA的区别大肠杆菌遗传物质1、部位不同：2、大小不同：质粒分子量较小，大小只有普通细菌染色体DNA的百分之一。基因组DNA分子量较大，细菌基因组约含3000个基因，5106bp。基因组DNA容易断裂线性化碱裂解法提取质粒的原理原理：1、强碱和SDS裂解细菌，细菌中的质粒或基因组DNA在碱性条件下发生变性。2、怎样去除基因组DNA？当加入酸性物质进行中和时，质粒DNA很快复性，染色体DNA则和变性蛋白质等缠绕在一起难以复性而形成沉淀，经离心随细胞碎片一起去除；3、怎样去除蛋白质？（已经学过）留有质粒DNA的上清，经酚和氯仿去除蛋白质后,用乙醇沉淀质粒DNA，即得到质粒DNA.1)细胞悬浮液（溶液I）--悬浮菌体50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.HclPH8.010mmol/LEDTA.Na2PH8.02)细菌裂解液（溶液II）--裂解菌体0.2mol/LNaOH1%SDS碱裂解法提取质粒试剂：3）中和液（溶液III）----中和NaOH60ml5mol/L醋酸钾11.5ml冰醋酸28.5ml水4）20mg/mlRNase----降解细菌RNA工作浓度30～50g/ml其他试剂作用和成分同实验一。质粒DNA的制备录像5分钟：（8：20~8：25）（1）（细菌的收获：）取1.5ml工程菌液6,000转/分，离心2min，弃上清。（2）（细菌的裂解：）加入200l预冷的细胞悬浮液（溶液I）悬浮细菌加入200l细菌裂解液（溶液II），颠倒混合离心管内容物，待溶液变粘稠为止。注：粘稠：开盖后出现拉丝现象，证明DNA已经游出。（3）（中和：）加入150l中和液，上下颠倒混合后置冰上5min，12,000转/分，4℃离心5min。碱裂解法提取质粒操作步骤开始操作：（去除蛋白质）（4）将上清移至另一离心管中(注意不要混入白色沉淀物)，加入等体积的TE饱和的酚/氯仿/异戊醇(25：24:1)混和液，振荡混匀1min，12,000转/分离心5min。（5）将上层水相移至另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)溶液，振荡混匀1min，12,000转/分离心5min。（沉淀DNA）（6）将上层水相移至另一离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，置-20℃沉淀10－15min。上午实验结束下午实验内容１继续提取质粒：获取及溶解沉淀的质粒DNA2质粒DNA电泳分析：（7）12,000转/分离心5min。弃上清，室温干燥质粒DNA5-10min。（去除RNA）（8）用20l含RNase的水溶解质粒DNA，轻轻吹打混合。37℃保温10min20l质粒DNA溶液取出10l放于另一个离心管中备用剩余10l用于下一步酶切继续实验操作取10l的质粒DNA加2l上样液混匀。加到0.8%琼脂糖凝胶的加样孔内。电泳条件：100V40min。电泳结束后照像保存，结果分析。质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳质粒提取方法质粒的量质粒的纯度要求决定使用不同的方法质粒的大小质粒过大：温和裂解质粒大小适中：碱裂解，煮沸法如：如：大量提取质粒：二次扩增细菌，纯化方法要复杂小量提取质粒：单克隆培养，普通碱裂解法质粒纯度：要求高纯度、无内毒素等等（满足各种转基因实验的要求）要求不同的纯化方法电泳时讲授10-20min方法举例：经典的方法：CsCl-溴化乙锭梯度密度离心特点：纯度最高（可获得高质量的超螺旋质粒DNA）、最贵、最麻烦应用：大量制备质粒；基因注射，基因转染等对质粒质量要求高的实验缺口环状或线状DNA闭环质粒DNA原理：不同结构和大小的DNA参入的溴化乙锭的量不一样从而在CsCl梯度密度离心中处于不同的位置特点：小量质粒制备、最简便、快捷应用：质粒酶切鉴定、克隆（粗提）测序、转染（细提）质粒提取试剂盒常用方法：小量碱裂解法满足不同需要的试剂盒纯化原理：离子交换柱层析等小量制备质粒kit大量制备质粒kit去除内毒素制备质粒kit可用于大部分分生实验质粒的电泳质粒DNA的3种形式泳动速度:超螺旋线性开环质粒DNA的存在形式有3种:1、共价闭环DNA:常以超螺旋形式存在2、开环DNA:质粒DNA两条链中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力,形成松弛的环状分子3、线性DNA:因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成.开环超螺旋线性重组质粒的鉴定平板筛选：大多数情况下，平板筛选只能区分含有或未含有质粒的细胞，却无法区分含有空质粒或重组质粒的细胞提取的质粒质粒电泳筛选重组质粒重组质粒的进一步酶切鉴定质粒电泳空质粒重组质粒重组质粒分子量变大而在电泳中滞后质粒酶切电泳a:酶切前b:酶切后插入片段注：观察质粒的电泳带型分析质粒切不开的原因。