关于IVD产品线性范围的建立与验证讨论

线性范围的建立与验证线性范围的定义线性范围（LinearRange）是指检测系统最终输出值（浓度或活性）与被分析物的浓度成正比的范围。线性范围不涉及检测的准确性评估几个概念的区别分析测量范围（AnalyticalMeasurementRange）临床可报告范围（ClinicalReportableRange）最低检测限（LowestLimitofDetection）指某一分析方法在给定的可靠程度内可以从样品中检测待测物质的最小浓度或最小量。所谓检测是指定性检测，即能将待测物从背景噪声中区分出来的最小浓度，而无需定量准确。方法可采用对标本的稀释、浓缩或者其他预处理用于扩展直接分析测量下的分析物值的浓度范围。方法直接测量标本，而无需任何稀释、浓缩或其它预处理等过程的条件下，测量结果总误差符合要求的分析物的浓度范围。功能灵敏度（FunctionalSensitivity）以日间重复CV为20%时对应检测限样品具有的平均浓度确定为检测系统或方法可定量报告的分析物的最低浓度或其它量值。几个概念的区别样品中不含待测物概率≤95%或99.6%最低检测限：样品中大概率含待测物（95%以上），但不能准确定量功能灵敏度：能够准确定量分析测量范围：不经预处理能够准确定量的范围线性范围：方法可采用对标本的稀释、浓缩或者其他预处理用于扩展直接分析测量下的分析物值的浓度范围，通常包括可报告范围和分析测量范围线性范围的建立与验证CLSIEP6及《中华人民共和国卫生行业标准——定量测定方法线性评价》对线性范围的建立和验证作了详细要求。总体流程基本条件保证及误差确定样本准备检测方案数据处理1.基本条件及误差确认人员：熟悉方法原理与操作，能正确处理样本，确保仪器状态正常，并能使用适当的校准品对仪器进行校准。仪器：仪器性能指标符合标称值，无明显携带污染。试剂及校准品：应使用同批号的试剂及配套的同批号校准品。2.样本准备样本基本要求：样本基质应与临床实验样本相似，且不含有对测定方法具有明确干扰作用的物质，理想的样本是分析物浓度接近预期可报告范围上限和下限的人血清或其它方法要求的样本，如果实验中可能用到多种基质标本类型，则应评价每种基质类型。2.样本准备最佳基质样本不易获得时替代方案接近预期可报告范围上限浓度的人体样本添加分析物。若分析物中不含干扰物，则添加的分析物无需高纯度，否则需记录添加分析物的来源、纯度及预期影响等。如果含分析物的浓溶液加入病人样本中时，原则上应少于总体积的10%，并记录溶剂。接近预期可报告范围下限浓度的人体样本1st2nd3rd4th使用厂家推荐的或实验室已证实可用的稀释液低浓度或经处理过降低了分析物浓度的低浓度人体样本使用商业质控物/定标物/线性物质，注意分析物要保持正常生理状态下的形式（结合态或代谢产物）盐水或其它非推荐的稀释液，使用最小量稀释，并可查证其可用5th6th7th低稀释/过稀释的商业质控物，稀释液需查证可用，以最小量稀释，并保证质控物完全溶解水溶液其它溶剂，有机溶剂可能带来更大的基质效应2.样本准备准备足量的高值（H）样本和低值（L）样本，经不同比例混合配制成中间浓度样本（Xn），比例关系可按等间距或其它确定的比例。其中有几个重要的浓度水平需要考虑：1.最低分析浓度或线性范围下限2.不同的医学决定水平值3.最高分析浓度或线性范围上限2.样本准备例：等间距稀释5个点序号12345比例LH等比稀释5个点(1/2比例）序号12345比例LHConcentration=(L×VL+H×VH）/（VL+VH）3.样本测定建立线性范围：9-11个样本，超出20%-30%预期线性范围（上、下限），每样本重复测定2-4次。验证声明线性范围或改良方法：7-9个样本，覆盖线性范围，每样本重复测定2-3次。实验室内证实线性范围有效性：5-7个样本，每样本重复测定2次。5个测量点是最低要求，当然更多的测量点能更精确地评价线性。全部实验和数据采集应在同一批内或相隔较短的实验批次内完成，样本随机排列，若有显著携带污染，应用空白样本隔开。4.数据处理检查数据有效性和可接受性•检查是否存在极端明显的差异（或错误），是否存在潜在的离群点•目视判断是否存在漂移或趋势性变化离群值检查•离群值仅适用于某评价单个重复测定结果，而不适用于测量均值•单个离群值可直接删除，2个及以上者需检查系统精密度，并按标准方法删除精密度检验•精密度检验确定线性范围•多项式回归•多项式线性评价4.数据处理检查离群点（Dixon法）将每次测定的4个浓度从大到小排列为（Yi-1至Yi-4）计算极差D=Yi-1-Yi-4计算D1=(Yi-1-Yi-2)/D计算D4=(Yi-3-Yi-4)/D若D1或D4大于0.765（p=0.05）或0.889（p=0.01），则该点为离群点4.数据处理多项式线性评价首先假设数据点是非线性的，在随机误差很小的前提下，数据点都能完整的地落在线性或曲线范围内。无论最适曲线是否为直线，都不影响（线性范围内）数据点之间其它浓度的反应状态，并可得到连续、可靠的结果的能力。多项式回归应进行1-3项式的回归阶次回归方程回归自由度（Rdf）一次Y=b0+b1X2二次Y=b0+b1X+b2X23三次Y=b0+b1X+b2X2+b3X344.数据处理回归方程的线性检验：对回归方程进行线性检验就是对每个非线性系数（b2、b3）做t检验，判断回归系数与零是否存在显著性差异。计算t值•t=bi/SEi•bi：非线性系数SEi=每个非线性系数斜率的标准误n：总测定次数计算自由度•Df=L×R-Rdf•L：检测样本数；R：每样本检测数；Rdf：回归自由度查询界值•在t值表中查询t界值（双边检验，α=0.05），将计算出的t值与界值比较，若p＞0.05,则表示数据组具线性，反之则为非线性，此时应进行临床标准的线性与非线性检验。=𝒃𝒊𝒚−𝒀𝟐−𝒙−𝑿𝒚−𝒀𝟐𝒙−𝑿𝟐𝒏−𝟐𝒙−𝑿𝟐4.数据处理最优拟合方程的判断通过回归标准误差（SDy,x）判断，确认最适多项式的模型，SDy,x越小，说明模型越适合。回归标准误差指独立变量Y与预期变量X相对应的可估计变量Y’平均值之间的差量检测大小。建议使用SPSS来判断最佳拟合方程y=0.0061x2+0.2864x+7.8332y=0.0001x3-0.0198x2+1.5463x-0.02710204060801001201401600204060801001201404.数据处理回归方程线性检验：临床标准的线性检验中使用了两个统计量，ADL（偏离直线平均差异，averagedeviationfromlinearity）和PctBnd（百分区界percentbound）。ADLPctBnd•一般设定ADL≤5%为临床允许误差，即取PctBnd为5%，通过查表得到ADL临界值。如ADL小于临界值，可认为多项式具有临床可接受的非线性，为二阶线性。如ADL大于临界值，则为临床不可接受的非线性。4.数据处理精密度检验计算最优拟合方程回归标准误σ𝝈=𝒚𝒊−𝒑𝒙𝒊𝟐𝒏𝒊=𝟏𝒏−𝒅−𝟏yi:各测量值p(xi)：最优拟合方程拟合值n：样本数乘以重复次数d：最优拟合方程阶数L：样本数；R：重复测定次数；C：常数，取值见下表；PctBnd:取5%。𝒄:平均测量浓度最优拟合方程阶数精密度界值常数C1阶或2阶6.33阶6.5不精密度满足判断式时,说明数据的精密度好可作线性评价。反之则表示数据的精密度差，不能作线性评价。线性评价流程设计方法和确定误差标准（非线性和重复性）按照设计方法进行检测目测结果是否存在明显离群、漂移或趋势离群值检验线性回归线性检验精密度检验范围确认或调整发布线性范围简化的方法样本选择：研发部选择超出预期线性范围20%-30%左右的浓度生产、质管预期范围内接近上下限的样本，低值尽量不要选用纯水简化的方法研发部：下限的确定：建议使用功能灵敏度来作为线性范围下限。上限的确定：建议使用SPSS等统计软件来确定最佳拟合曲线，利用最佳拟合曲线来计算ADL，逐渐降低上限浓度直至ADL≤5%。简化的方法生产、质管部：以预期值为横坐标，测定值为纵坐标，建立回归方程y=bx+a，将预期浓度代入方程，计算估算值。估算值与实测值平均差值应不大于声明的相对或绝对偏差，否则为不满足线性。